小鼠与大鼠模型中微胶质细胞的组织学及图像分析

对啮齿动物模型组织切片中的小胶质细胞进行多重免疫荧光染色、分割、形态和空间分析。

小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）稳态和疾病进展的核心决定因素，影响着包括阿尔茨海默病（AD）在内的各种主要适应症：

• 阿尔茨海默病（AD）

• 与 Tauopathy 相关的痴呆症（如FTD、CBD、PSP）

• 帕金森病 (PD)

• 肌萎缩侧索硬化症（ALS）

• 多发性硬化症（MS）

小胶质细胞特征的定量分析，包括密度、基于形态学的激活状态评分和神经元相关接触拓扑，对于衡量疾病进展和治疗反应至关重要。Biospective 开发了强大的 多重免疫荧光 (mIF) 染色 和自动整片定量工作流程，这些流程针对以病理学为中心的微环境分析和啮齿类中枢神经系统组织中的小胶质细胞-神经元相互作用终点进行了优化。

我们的小胶质细胞染色和图像分析能力

基于 Iba1 的小胶质细胞定量分析

• 在指定的感兴趣区进行整张幻灯片 Iba1 染色密度定量和区域负担定量，最大限度地减少取样偏差，并支持队列规模比较。

小胶质细胞分割和基于形态学的活化谱分析

• 小胶质细胞的整片检测和分类。

• 从 Iba1 阳性细胞中提取高含量形态计量学数据，并使用经过训练和验证的机器学习模型进行分析，以识别微妙的状态变化。

• 输出结果包括体节大小和形状重塑、过程长度 和分支结构，从而实现客观的形态驱动亚分类和连续状态评分。

与作用机制相一致的多重表型分析

• 小胶质细胞状态标志物面板与 mIF 中的 Iba1 相结合，通常最多有四个目标和 DAPI，针对啮齿动物模型、组织类型和终点策略进行了优化。标记物可量化为感兴趣区和分割细胞内的染色密度，以获得细胞表达谱。常见标记包括

  • 小胶质细胞的特征和平衡状态：TMEM119、CD11b

  • 吞噬体负担和吞噬负荷：LAMP1、CD68

  • 反应性炎症激活和免疫环境：CD45、TREM2

  • 效应途径背景：iNOS、补体成分（如 C1q）

  • 炎症体参与ASC、裂解的 Caspase-1

  • 嘌呤能信号传导P2RY12

病理学微环境分析

• 病理学和微环境标记物可以整合在一起，量化小胶质细胞状态如何随局部病理负担和病理定义病灶的邻近程度而变化，从而在炎症微环境中实现空间分辨的生态位表型。渠道可能包括

  • AD 模型：Aβ 斑块标记物（纤维淀粉样蛋白、6E10/4G8、pFTAA）和 tau 标记物（AT8、PHF1、MC1、p-Tau217、裂解 tau N368/Asp412）

  • ALS 模型：磷酸化-TDP-43（p409/410）、人类 TDP-43、总 TDP-43

  • 多发性硬化症模型：髓鞘完整性标记物（如 MBP）

  • 结构和血管标记物：GFAP、层粘连蛋白

• 输出包括染色密度和小胶质细胞形态等指标的剖析，这些指标是与病理距离的函数，以及特定标记物的共聚焦。

小胶质细胞与神经元直接相互作用的量化

• 通过添加神经元标记物（如NeuN），小胶质细胞与神经元之间的直接接触可以得到表征。

• 交互作用的大小和位置（小胶质细胞过程到神经元体节或体节到体节）都可以自动量化。

完善的脑样本制备、染色、玻片扫描和定量图像分析规程。

我们的小胶质细胞染色和分析流程

在 Biospective，我们对福尔马林固定大脑中的小胶质细胞进行染色和分析时，采用了标准化、可重现性高的多步骤流程：

1. 样品制备

   • 对 FFPE 或固定冷冻大脑进行 高精度 显微切片或冷冻切片。

   • 针对 Iba1、NeuN 和小胶质细胞活化标记物进行优化的定制抗原检索方案，最大限度地提高信噪比，以支持定量图像分析所需的细微特征的检测。检索条件还可根据多重面板中包含的其他抗体进一步定制。我们通常采用甲酸回收、热诱导回收（HIER）、酶回收或这些方法的组合。

   • 对染色质量和特异性以及组织完整性进行严格的质量控制 (QC)。

2. 染色（IHC 或 多重 IF）

   • 根据所需的分析结果配置标记板，通常包括

     • Iba1（小胶质细胞）

     • NeuN（神经元体；需要细胞间相互作用终点时）

     • 疾病模型相关病理（如Aβ、p-tau、p-Syn129、phospho-TDP-43）

     • 小胶质细胞状态或通路标记物（如CD68、TREM2、ASC）

     • DAPI（细胞核）

   • 多重分析的优势

     • 多重成像可在单张载玻片上对微环境进行细胞类型特异性分析，准确描述单个斑块周围细胞的特征。

3. 成像

   • 全切片多通道荧光扫描

4. 定量分析
   我们开发了用于多重免疫荧光的全自动定量分析：

   • 小胶质细胞 (Iba1)、神经元体节 (NeuN) 和模型相关病理标记物的全自动分割

   • 高通量、基于区域的小胶质细胞负担和形态衍生状态指标报告

   • 当 NeuN 包括在内时，接触分析解决了两种相互作用拓扑：

     • 小胶质细胞过程与神经元体节的接触

     • 小胶质细胞体与神经元体节的接触，包括定量接触面积。

样品采集、制备和运输指南

我们提供全面的支持，以确保样本的完整性和数据的可靠性：

• 样本采集：动物应用冷 PBS 和/或 10% 中性缓冲福尔马林灌注，并仔细提取大脑。

• 样本制备： 大脑必须在 10%中性缓冲福尔马林中进行适当的短暂固定。

• 样本运输： 样本必须 在含叠氮化钠的 PBS 中运输。

简要概述神经疾病模型中的小胶质细胞反应性，以及为什么严格的定量分析至关重要。

小胶质细胞通过持续的实质监视、免疫感应和严格调控的吞噬清除来维持组织稳态。在疾病中，小胶质细胞会转变为异质性的激活状态，这种状态具有区域模式化和阶段依赖性，与选择性神经元脆弱性以及突触和回路级功能障碍的出现相一致。这些状态的转变反映在 可量化的形态重塑上，包括基质肥大和更短、更粗、更多分支的过程。

在功能上， 小胶质细胞从监视状态 转变为效应状态，这意味着它们从主要感知和维持体内平衡转变为执行明确的反应程序，通过炎症信号、氧化机制、补体级联和溶酶体偶联吞噬作用积极改变局部微环境。

这些结构变化通常伴随着

• 促炎细胞因子和趋化因子的产生和释放增加

• 活性氧和氮物种的生成

• 补体相关程序

• 吞噬溶酶体和吞噬细胞负荷增加

在正常和病理情况下， 小胶质细胞 出于多种目的直接与神经元相互作用， 如突触修剪和发育（Paolicelli， 2011 年； Schafer， 2012 年）和轴突导向（Squarzoni， 2014 年）。最近，有人提出，小胶质细胞过程和神经元躯体之间的特化位点（称为躯体嘌呤能交界处）是小胶质细胞感知神经元健康的关键位点（Cserép， 2020， 2021）。研究发现，这些部位在神经元一侧与线粒体相关，在小胶质细胞一侧与嘌呤能受体 P2Y12R 相关。虽然体节在神经退行性疾病中的作用在很大程度上仍未被探索，但有几项证据表明它们可能发生了改变，包括急性脑损伤模型中相互作用频率的增加（Cserép， 2020 年）、 这些情况下的线粒体功能障碍，以及 Biospective 的研究显示这些相互作用与帕金森病小鼠模型中的神经退行性之间存在密切联系。

我们对激活的小胶质细胞进行分类的方法概述。

分析方法概述

• 利用计算机视觉和深度学习方法对整张切片图像上的细胞进行检测和分割。

• 然后提取形态学特征，如基底区域、过程中分支点的数量等。

• 根据这些特征，细胞被分类为激活或未激活，并由机器学习模型分配一个连续的激活分数。

• 然后将这些指标按神经解剖感兴趣区（ROI）、受试者和组别汇总，进行统计分析。

活化小胶质细胞分析的价值何在？

• 比简单量化 Iba1 染色密度的效果更大。 在多种情况下，例如在阿尔茨海默病和帕金森病的小鼠模型中，Biospective 观察到使用小胶质细胞形态学分析进行组间比较的效应比测量 Iba1 染色密度更大。在临床前药效研究中，这一结果意味着用较小的组群规模就能检测到相同的药物效果。

• 与转化相关的临床指标相关。我们的小胶质细胞形态学分析表明，它与运动评分和核磁共振成像脑容量等转化相关临床指标有很强的相关性，使其成为了解潜在疗法效果的重要依据。

细胞间相互作用的量化方法摘要以及 TDP-43 ALS 小鼠模型的示例。

为了分析神经元和小胶质细胞之间的直接相互作用，我们在薄组织切片中进行多重免疫荧光，包括小胶质细胞（如Iba1）和神经元（如NeuN）标记物。Biospective 平台可自动识别和量化每种相互作用的特性：

• 大小：重叠面积、覆盖细胞周界的比例等。

• 类型/亚细胞定位：神经元体-神经元体或小胶质细胞-神经元体

然后，可按神经解剖区域、受试者和组别计算汇总统计数据（例如，具有过程到瘤相互作用的小胶质细胞的比例），以便进行统计分析。

为了说明我们的工作流程，我们将这一图像处理和分析管道应用于 Biospective 公司开发的新型 TDP-43 蛋白病小鼠模型大脑的 mIF 图像。非转基因、野生型（WT）C57BL/6小鼠单侧注射AAV-hTDP43ΔNLS（或作为对照的AAV-null）至黑质紧实旁（SNc）。注射后 6 周收集大脑。

在这项研究中，我们发现，与对照组相比，AAV-hTDP43ΔNLS 组具有以下特征

• 广泛的小胶质细胞病变，Iba1 染色密度和形态学分析中获得的活化小胶质细胞密度均显著增加。

• 小胶质细胞与神经元之间有更多的相互作用：

  • 更多的神经元与小胶质细胞发生了相互作用。

  • 尽管小胶质细胞的总数大幅增加，但与神经元发生相互作用的小胶质细胞比例却更大。有趣的是，与纯粹的小胶质细胞指标相比，这一指标具有更强的统计学意义。

  • 小胶质细胞过程与神经元体节相互作用和体节与体节相互作用的密度都有大幅增加。

• 相互作用的性质发生变化，因为相互作用的规模更大。

• 这些相互作用似乎是小胶质细胞对病理的直接反应：单个细胞内的病理负担越重（以 hTDP43/pTDP43 标记衡量），这些细胞就越有可能发生相互作用。

• 因此，这些先进的指标对临床前疗效研究 具有 很高的价值。 灵敏度越高，意味着使用相同的队列规模可以检测到更小的效应规模。此外，这些指标还能提供有关神经元健康、治疗相关的小胶质细胞病理反应以及小胶质细胞与神经元相互作用的详细见解。

互动展示我们的研究成果

在下面的 "图像互动 "中，您可以看到我们的小胶质细胞-神经元相互作用分析结果，包括我们专有的诱导型 TDP-43ΔNLS 模型和对照组小鼠大脑的高分辨率多重免疫荧光组织切片。 和对照小鼠的高分辨率多重免疫荧光组织切片。

如何使用我们的交互式浏览器
通过左侧面板或屏幕上的箭头浏览 "图像故事"。您可以用鼠标平移高分辨率显微图像，并使用滚轮或 +/- 控制器放大/缩小。控制面板（右上角）允许切换图像通道和分割叠加。为获得最佳体验，我们建议切换到全屏模式。 通过该互动演示，您可以像直接在显微镜下观察一样，详细了解模型的神经病理学和相关功能障碍。

Biospective 小胶质细胞染色和分析服务的主要优势：

• 高灵敏度小胶质细胞 检测

• 可选的小胶质细胞表型标记物染色，包括定制抗体/标记物染色

• 高通量、自动化全玻片成像和神经解剖区域分析

• 独特的全自动定量图像分析

  • 小胶质细胞形态和激活状态

  • 小胶质细胞与神经元的相互作用

  • 空间邻近性分析（如 Aβ 斑块）

• 跨物种（小鼠、大鼠）兼容性

• 补充服务（如通过免疫测定测量组织和体液细胞因子浓度）

Biospective 平台提供的淀粉样斑块环境指标选择

本表比较了 Biospective 平台提供的各种量化小胶质细胞指标。

我们积极开展研究与创新 (R&I) 计划，重点研究小胶质细胞和星形胶质细胞在神经退行性疾病、神经肌肉疾病和神经炎症疾病中的复杂作用。

在 Biospective，我们认识到神经炎症在神经系统疾病中的关键作用，以及对神经炎症反应进行靶向治疗调节的价值。作为公司内部研究和创新工作的一部分，我们正积极致力于更好地了解神经炎症在疾病发病机制中的作用。我们目前的活动包括

• 我们的小胶质细胞、星形胶质细胞和神经退行性疾病倡议--收集了一系列原创演讲和资源，探讨神经炎症和神经退行性疾病之间的复杂关系。

• 分析渐冻症、阿尔茨海默病、帕金森病、陶氏病和多发性硬化症动物模型中的小胶质细胞和星形胶质细胞。

• 开发描述小胶质细胞和星形胶质细胞表型的新方法，以及它们与错误折叠蛋白（如淀粉样蛋白-β、α-突触核蛋白、tau、TDP-43）、神经元及其过程、脑血管、外周炎症等的空间关系。

讨论您的研究要求或索取小胶质细胞染色和图像分析服务报价：

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