マウスおよびラットモデルにおけるミクログリア組織学と画像解析

齧歯類モデルの組織切片におけるミクログリアの多重免疫蛍光染色、セグメンテーション、形態学的および空間的解析。

ミクログリアは、中枢神経系（CNS）のホメオスタシスと疾患進行の中心的な決定因子である：

• アルツハイマー病（AD）

• タウオパチー関連認知症（FTD、CBD、PSPなど）

• パーキンソン病（PD）

• 筋萎縮性側索硬化症（ALS）

• 多発性硬化症（MS）

密度、形態学に基づく活性化状態スコアリング、ニューロン関連接触トポロジーなど、ミクログリアの特徴を定量的に解析することは、疾患の進行や治療反応を測定する上で極めて重要である。Biospective社は、 齧歯類の中枢神経系組織における病理学中心の微小環境プロファイリングとミクログリア・ニューロン相互作用のエンドポイントに最適化された、頑健な 多重免疫蛍光（mIF） 染色と自動化された全スライド定量化ワークフローを開発しました 。

ミクログリアの染色と画像解析能力

Iba1ベースのミクログリオーシス定量化

• 全スライドIba1染色密度の定量化と、指定した関心領域内の領域負担の定量化により、サンプリングバイアスを最小限に抑え、コホートスケールでの比較をサポートします。

ミクログリアのセグメンテーションと形態学に基づく活性化プロファイリング

• ミクログリアの全スライド検出と分類。

• Iba1陽性細胞から抽出された高コンテントの形態計測値を、訓練され検証された機械学習モデルで解析し、微妙な状態変化を同定する。

• 出力にはソーマのサイズと 形状のリモデリング、突起の長さ 、分岐構造が含まれ、客観的な形態学に基づくサブ分類と連続的な状態スコアリングが可能。

作用機序に沿ったマルチプレックスフェノタイピング

• mIFのIba1と組み合わせたミクログリアステートマーカーパネルは、通常最大4つのターゲットとDAPIを含み、げっ歯類モデル、組織タイプ、エンドポイント戦略に合わせて最適化されている。マーカーは、関心領域およびセグメント化された細胞内の染色密度として定量化し、細胞発現プロファイルを得ることができる。一般的なマーカーは以下の通り：

  • ミクログリアのアイデンティティと恒常性状態：TMEM119、CD11b

  • ファゴライソソーム負荷と貪食負荷：LAMP1、CD68

  • 反応性炎症活性化と免疫背景：CD45、TREM2

  • エフェクターパスウェイコンテキスト：iNOS、補体成分（C1qなど）

  • インフラマソームの関与ASC、切断カスパーゼ-1

  • プリン作動性シグナル伝達P2RY12

病理学的微小環境解析

• 病理学的マーカーと微小環境マーカーを統合することで、ミクログリアの状態が局所的な病理学的負荷や病理学的に定義された病巣への近接性によってどのように変化するかを定量化することができ、炎症性微小環境における空間的に解像されたニッチ表現型の解析が可能となる。チャンネルには以下のようなものがある：

  • ADモデル：Aβプラークマーカー（線維性アミロイド、6E10/4G8、pFTAA）およびタウマーカー（AT8、PHF1、MC1、p-Tau217、切断タウN368/Asp412）

  • ALSモデル：リン酸化TDP-43（p409/410）、ヒトTDP-43、総TDP-43

  • MSモデル：ミエリン完全性マーカー（ MBPなど）

  • 構造および血管マーカーGFAP、ラミニン

• 出力には、病態への距離の関数としての染色密度やミクログリアの形態、特定マーカーの共局在化などのメトリクスのプロファイリングが含まれる。

ミクログリア-ニューロン直接相互作用の定量化

• 神経細胞マーカー（例えばNeuN）を加えることにより、ミクログリアと神経細胞間の直接接触を特徴付けることができる。

• 相互作用のサイズと位置（ミクログリアプロセスから神経細胞ソーマまたはソーマ-ソーマ）の両方を自動的に定量化できる。

脳サンプルの調製、染色、スライドスキャン、定量的画像解析のための確立されたプロトコール。

ミクログリア染色と解析のプロセス

Biospective社では、ホルマリン固定脳からのミクログリアの染色と解析のために、標準化された再現性の高い多段階プロセスを導入しています：

1. サンプル調製

   • FFPEまたは固定凍結脳の 高精度 ミクロトーム切片化または凍結摘出。

   • Iba1、NeuN、ミクログリア活性化マーカーに最適化されたカスタム抗原回収プロトコルで、定量画像解析に必要な微細な特徴の検出をサポートするためにシグナル対バックグラウンドを最大化する。マルチプレックスパネルに含まれる追加抗体については、検索条件をさらにカスタマイズします。私たちは、ギ酸回収、熱誘導回収（HIER）、酵素回収、またはこれらの方法の組み合わせを日常的に行っています。

   • 染色の質と特異性、および組織の完全性の厳格な品質管理（QC）。

2. 染色（IHC または Multiplex IF）

   • マーカーパネルは目的の解析に基づいて構成され、多くの場合、以下の組み合わせとなる：

     • Iba1（ミクログリア）

     • NeuN（ニューロンソーマ；細胞間相互作用のエンドポイントが必要な場合）

     • 疾患モデルに関連した病理（例：Aβ、p-tau、p-Syn129、phospho-TDP-43）

     • ミクログリアの状態または経路マーカー（例：CD68、TREM2、ASC）

     • DAPI（核）

   • マルチプレキシングの利点

     • マルチプレキシングにより、1枚のスライドで微小環境の細胞タイプ特異的解析が可能となり、個々のプラークを取り巻く細胞景観を正確に特徴付けることができる。

3. イメージング

   • 全セクションマルチチャンネル蛍光スキャン

4. 定量分析
   マルチプレックス免疫蛍光の全自動定量解析を開発しました：

   • ミクログリア(Iba1)、ニューロンソーマ(NeuN)およびモデル関連病理学マーカーの全自動セグメンテーション

   • ミクログリア負荷および形態学由来の状態メトリクスの高スループット、領域ベースの報告

   • NeuNを含めると、接触解析は2つの相互作用トポロジーを解決する：

     • ミクログリアプロセスからニューロンソーマへの接触

     • ミクログリアソーマからニューロンソーマへの接触（定量的接触面積を含む）。

サンプル採取、準備、発送のガイドライン

サンプルの完全性とデータの信頼性を確保するため、包括的なサポートを提供します：

• サンプル採取：動物を冷PBSおよび/または10%中性緩衝ホルマリンで灌流し、脳を注意深く抽出する。

• サンプル調製： 脳は10％中性緩衝ホルマリンで短時間適切に固定する。

• 検体の輸送： 検体はアジ化ナトリウムを含むPBSで輸送する 。

神経疾患モデルにおけるミクログリア反応性の概要と、厳密な定量的解析が重要である理由。

ミクログリアは、連続的な実質監視、免疫感知、厳密に制御された貪食クリアランスを通じて、組織の恒常性を維持している。疾患では、ミクログリアは、選択的な神経細胞の脆弱性とシナプスや回路レベルの機能不全の出現に合わせて、領域的にパターン化され、段階に依存した不均一な活性化状態に移行する。このような状態変化は、 ソーマの肥大や、より短く、より太く、より枝分かれした突起など、定量可能な形態学的リモデリングによって反映される 。

機能的には、 ミクログリアは監視状態から つまり、炎症シグナル伝達、酸化メカニズム、補体カスケード、リソソーム共役型貪食作用などを通じて、主にホメオスタシスを感知・維持することから、局所微小環境を積極的に改変するような、定義された反応プログラムを実行することへと移行する。

このような構造的変化は、一般的に以下を伴っている：

• 炎症性サイトカインおよびケモカインの産生および放出の増加

• 活性酸素および窒素種の発生

• 補体関連プログラム

• ファゴライソソームおよび食細胞負荷の上昇

正常な状態でも病的な状態でも、 ミクログリアは シナプスの刈り込みや発達（Paolicelli, 2011; Schafer, 2012）、軸索誘導（Squarzoni, 2014 ）など、複数の目的で神経細胞と直接相互作用している。近年、ミクログリア突起と神経細胞体間の特殊な部位（体性プリン作動性接合部と呼ばれる）が、ミクログリアが神経細胞の健康状態を感知する重要な部位であることが提唱されている（Cserép, 2020, 2021）。これらの部位は、神経細胞側ではミトコンドリアと、ミクログリア側ではプリン作動性受容体P2Y12Rと関連していることがわかった。神経変性疾患におけるソマティックジャンクションの役割についてはまだほとんど解明されていないが、急性脳損傷モデルにおける相互作用の頻度の増加（Cserép, 2020）、 これらの病態におけるミトコンドリア機能障害、パーキンソン病モデルマウスにおけるこれらの相互作用と神経変性との強い相関を示すBiospective社の研究結果など、いくつかの証拠が、それらが変化している可能性を示唆している。

活性化ミクログリアの分類方法の概要。

解析手法の概要

• コンピュータビジョンとディープラーニングのアプローチを用いて、スライド全体の画像から細胞を検出し、セグメンテーションする。

• そして、ソーマの面積、突起の分岐点の数などの形態学的特徴を抽出する。

• これらの特徴に基づき、細胞は活性化されているか否かに分類され、機械学習モデルによって連続的な活性化スコアが割り当てられる。

• これらの指標は、統計解析のために神経解剖学的関心領域（ROI）、被験者、グループごとに集計される。

活性化ミクログリア解析の価値とは？

• 単にIba1染色密度を定量化するよりも大きな効果量。 アルツハイマー病や パーキンソン病のマウスモデルなど複数の状況において、Biospective社はミクログリア形態学的解析を用いた群間比較において、Iba1染色密度を測定するよりも大きな効果量を観察した。前臨床有効性試験の文脈では、この結果は、同じ薬効がより少ないコホートサイズで検出可能であることを意味する。

• 臨床に関連した指標との相関。我々のミクログリア形態学的解析は、運動スコアやMRI脳容積など、臨床に関連する指標と強い相関を示しており、治療薬の効果に関する貴重な知見となっている。

細胞間相互作用の定量化法の概要とTDP-43 ALSマウスモデルによる実例。

神経細胞とミクログリア間の直接的な相互作用を解析するために、薄い組織切片でミクログリア（Iba1など）と神経細胞（NeuNなど）のマーカーを含む多重免疫蛍光を行います。Biospectiveのプラットフォームは、各相互作用の特性を自動的に識別し、定量化します：

• サイズ：重なり面積、細胞周囲を覆う割合など。

• タイプ／細胞内局在：細胞腫-細胞腫、ミクログリアプロセス-神経細胞腫など。

次に、統計解析のために、神経解剖学的領域、被験者、グループごとに集計統計（例えば、突起-相間相互作用を持つミクログリアの割合）を計算することができる。

このワークフローを説明するために、Biospective社が開発した新規TDP-43タンパク症モデルマウスの脳から得られたmIF画像に、この画像処理・解析パイプラインを適用しました。非トランスジェニック、野生型（WT）C57BL/6マウスに、AAV-hTDP43ΔNLS（またはコントロールとしてAAV-null）を片側から黒質pars compacta（SNc）に注射した。注射後6週目に脳を採取した。

本研究では、対照群と比較して、AAV-hTDP43ΔNLS群では以下のことが判明した：

• Iba1染色密度と形態学的解析から得られた活性化ミクログリアの密度が強く増加した。

• ミクログリアとニューロンの相互作用の増加：

  • より多くのニューロンがミクログリアと相互作用した。

  • ミクログリアの総数が非常に増加しているにもかかわらず、ミクログリアのより多くの割合がニューロンと相互作用していた。興味深いことに、この指標は純粋なミクログリアベースの指標よりも強い統計的有意性を示した。

  • ミクログリア-プロセス間相互作用とソーマ-ソーマ間相互作用の両方の密度が大きく増加した。

• 相互作用が大きくなるにつれて、相互作用の性質が変化している。

• これらの相互作用は、病態に対するミクログリアの直接的な反応であるように思われた：個々の細胞内に存在する病態的負荷が大きいほど（hTDP43/pTDP43マーカーで測定）、これらの細胞が相互作用を起こす可能性が高くなった。

• 感度が 高いという ことは、同じコホート・サイズを使用しても、より小さなエフェクト・サイズが検出されることを意味します。さらにこれらの指標は、神経細胞の健康状態、病態に対する治療に関連したミクログリアの反応、ミクログリアと神経細胞の相互作用に関する詳細な洞察を提供する。

インタラクティブな研究発表

下記の "Image Interactive "では、ミクログリア・ニューロン相互作用解析の結果を見ることができる。 およびコントロールマウスの脳組織切片を含みます。

インタラクティブ・ビューアの使い方
左側のパネルまたは画面上の矢印を使用して、「Image Story」をナビゲートします。高解像度の顕微鏡画像をマウスでパンしたり、スクロールホイールや+/-コントロールを使ってズームイン/ズームアウトすることができます。コントロールパネル（右上）では、画像チャンネルとセグメンテーションオーバーレイを切り替えることができます。最高の体験を得るためには、フルスクリーンモードに切り替えることをお勧めします。 このインタラクティブプレゼンテーションでは、顕微鏡を直接覗き込むように、モデルの神経病理学と関連する機能障害を詳細に調べることができます。

バイオスペクティブのミクログリア染色＆解析サービスの主な利点：

• 高感度ミクログリア 検出

• カスタム抗体/マーカー染色を含むミクログリア表現型のマーカーによる染色（オプション

• 高スループットの自動化された全スライドイメージングと神経解剖学的領域解析

• 独自の全自動定量画像解析

  • ミクログリアの形態と活性化状態

  • ミクログリア-ニューロン相互作用

  • 空間的近接性解析（ Aβプラークなど）

• 異種（マウス、ラット）互換性

• 補完的サービス（例：イムノアッセイによる組織および体液中のサイトカイン濃度測定）

Biospective社のプラットフォームが提供するアミロイドプラーク環境指標の選択

この表は、Biospective社のプラットフォームが提供する様々な定量的ミクログリアメトリクスを比較したものです。

私たちは、神経変性疾患、神経筋疾患、神経炎症性疾患においてミクログリアとアストロサイトが果たす複雑な役割の解明に特に重点を置いた、活発な研究＆イノベーション（R&I）プログラムを展開しています。

バイオスペクティブ社では、神経炎症が神経疾患で果たす重要な役割と、神経炎症反応を標的とした治療法の価値を認識しています。社内の研究・技術革新の一環として、私たちは疾患発症における神経炎症の関与をより深く理解するために積極的に取り組んでいます。現在の活動は以下の通りである：

• ミクログリア、アストロサイト、神経変性疾患イニシアチブ-神経炎症と神経変性の複雑な関係を問うオリジナルプレゼンテーションとリソースのコレクション。

• ALS、アルツハイマー病、パーキンソン病、タウオパチー、多発性硬化症の動物モデルにおけるミクログリアとアストロサイトの分析。

• ミクログリアやアストロサイトの表現型や、ミスフォールディングタンパク質（アミロイドβ、α-シヌクレイン、タウ、TDP-43など）、神経細胞やそのプロセス、脳血管系、末梢炎症などとの空間的関係を特徴づける新しい方法の開発。

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