마우스 및 랫트 모델을 위한 미세아교세포 조직학 및 영상 분석

설치류 모델의 조직 섹션에서 미세아교세포의 다중 면역 형광 염색, 분할, 형태학적 및 공간적 분석을 수행합니다.

미세아교세포는 다음을 포함한 주요 적응증에서 중추신경계(CNS) 항상성 및 질병 진행을 결정하는 핵심 요소입니다:

• 알츠하이머병(AD)

• 타우병증 관련 치매(예: FTD, CBD, PSP)

• 파킨슨병(PD)

• 근위축성 측삭 경화증(ALS)

• 다발성 경화증(MS)

밀도, 형태 기반 활성화 상태 점수, 뉴런 관련 접촉 토폴로지를 포함한 미세아교세포 특징의 정량적 분석은 질병 진행 및 치료 반응을 측정하는 데 매우 중요합니다. 바이오스펙티브는 설치류 CNS 조직의 병리 중심 미세 환경 프로파일링 및 미세아교세포-신경세포 상호작용 엔드포인트에 최적화된강력한 다중 면역 형광(mIF) 염색 및 자동화된 전체 슬라이드 정량화 워크플로우를개발했습니다 .

미세아교세포 염색 및 이미지 분석 기능

Iba1 기반 미세아교세포증 정량화

• 전체 슬라이드 Iba1 염색 밀도 정량화 및 특정 관심 영역 내 지역적 부담을 통해 샘플링 편향을 최소화하고 코호트 규모의 비교를 지원합니다.

미세아교세포 세분화 및 형태 기반 활성화 프로파일링

• 전체 슬라이드에서 미세아교세포를 감지하고 분류합니다.

• Iba1 양성 세포에서 추출한 고함량 형태 측정을 훈련되고 검증된 머신러닝 모델로 분석하여 미묘한 상태 변화를 식별합니다.

• 산출물에는 소마 크기 및 모양 리모델링, 프로세스 길이 및 분기 아키텍처가 포함되어 있어 객관적인 형태학 중심의 하위 분류와 지속적인 상태 점수가 가능합니다.

작용 메커니즘에 맞춘 멀티플렉스 표현형 분석

• 설치류 모델, 조직 유형 및 엔드포인트 전략에 최적화된 mIF의 Iba1과 최대 4개의 표적 및 DAPI를 결합한 미세아교세포 상태 마커 패널. 마커는 관심 영역과 분할된 세포 내에서 염색 밀도로 정량화하여 세포 발현 프로파일을 얻을 수 있습니다. 일반적인 마커는 다음과 같습니다:

  • 미세아교세포 정체성 및 항상성 상태: TMEM119, CD11b

  • 식세포 리소좀 부담 및 식세포 부하: LAMP1, CD68

  • 반응성 염증 활성화 및 면역 맥락: CD45, TREM2

  • 이펙터-경로 컨텍스트: iNOS, 보체 성분(예: C1q)

  • 인플라마솜 참여: ASC, 절단된 카스파제-1

  • 퓨린성 신호 P2RY12

병리학 미세 환경 분석

• 병리 및 미세환경 마커를 통합하여 미세아교세포 상태가 국소 병리학적 부담과 병리학적으로 정의된 초점과의 근접성에 따라 어떻게 변화하는지를 정량화하여 염증성 미세환경 내에서 공간적으로 해결된 틈새 표현형 분석이 가능합니다. 채널에는 다음이 포함될 수 있습니다:

  • AD 모델: Aβ 플라크 마커(피브릴 아밀로이드, 6E10/4G8, pFTAA) 및 타우 마커(AT8, PHF1, MC1, p-Tau217, 절단된 타우 N368/Asp412)

  • ALS 모델: 포스포-TDP-43(p409/410), 인간 TDP-43, 총 TDP-43

  • 다발성 경화증 모델: 미엘린 무결성 마커(예: MBP)

  • 구조 및 혈관 마커 GFAP, 라미닌

• 결과물에는 병리와의 거리에 따른 염색 밀도 및 미세아교세포 형태와 같은 메트릭의 프로파일링과 특정 마커의 공동화(colocalization)가포함됩니다.

미세아교세포-신경세포 직접 상호작용의 정량화

• 뉴런 마커(예: NeuN)를 추가하면 미세아교세포와 뉴런 사이의 직접 접촉을 특성화할 수 있습니다.

• 상호작용의 크기와 위치(미세아교세포에서 뉴런 소마 또는 소마-소마까지의 과정)를 자동으로 정량화할 수 있습니다.

뇌 샘플 준비, 염색, 슬라이드 스캔, 정량적 이미지 분석을 위한 잘 정립된 프로토콜을 제공합니다.

미세아교세포 염색 및 분석 프로세스

바이오스펙티브에서는 포르말린 고정 뇌에서 미세아교세포를 염색하고 분석하기 위해 표준화되고 재현성이 높은 다단계 프로세스를 구현했습니다:

1. 샘플 준비

   • fFPE 또는 고정 동결 뇌의 고정밀 마이크로톰 절편 또는 동결 절편.

   • Iba1, NeuN 및 미세아교세포 활성화 마커에 최적화된맞춤형 항원 검색 프로토콜로신호 대 배경을극대화하여정량적 이미지 분석에 필요한 미묘한 특징의 검출을 지원합니다. 검색 조건은 멀티플렉스 패널에 포함된 모든 추가 항체에 대해 추가로 맞춤 설정할 수 있습니다. 당사는 포름산 검색, 열 유도 검색(HIER), 효소 검색 또는 이러한 방법의 조합을 일상적으로 수행합니다.

   • 염색 품질과 특이성, 조직 무결성에 대한 엄격한 품질 관리(QC)를 수행합니다.

2. 염색(IHC 또는 멀티플렉스 IF)

   • 마커 패널은 원하는 분석에 따라 구성되며, 종종 결합되기도 합니다:

     • Iba1(미세아교세포)

     • NeuN(신경세포체, 세포 간 상호작용 엔드포인트가 필요한 경우)

     • 질병 모델 관련 병리(예: Aβ, p-tau, p-Syn129, phospho-TDP-43)

     • 미세아교세포 상태 또는 경로 마커(예: CD68, TREM2, ASC)

     • DAPI(핵)

   • 멀티플렉싱의 장점

     • 멀티플렉싱은 단일 슬라이드에서 세포 유형별 미세 환경 분석을 가능하게 하여 개별 플라크를 둘러싼 세포 환경을 정확하게 특성화합니다.

3. 이미징

   • 전체 섹션 멀티채널 형광 스캐닝

4. 정량적 분석
   멀티플렉스 면역 형광을 위한 완전 자동화된 정량 분석을 개발했습니다:

   • 미세아교세포(Iba1), 신경세포체(NeuN) 및 모델 관련 병리 마커를 위한 완전 자동화된 세분화

   • 미세아교세포 부담 및 형태학에서 파생된 상태 메트릭의 높은 처리량, 영역 기반 보고

   • NeuN이 포함된 경우, 접촉 분석은 두 가지 상호 작용 토폴로지를 해결합니다:

     • 미세아교세포 과정-신경세포체 접촉

     • 정량적 접촉 면적을 포함한미세아교세포 소체-신경세포 소체 간 접촉.

샘플 수집, 준비 및 배송 가이드라인

샘플 무결성과 데이터 신뢰성을 보장하기 위해 종합적인 지원을 제공합니다:

• 샘플 수집: 동물은 차가운 PBS 및/또는 10% 중성 완충 포르말린으로 관류하고 뇌를 조심스럽게 추출해야 합니다.

• 샘플 준비: 뇌는 10% 중성 완충 포르말린에 간단히 적절히 고정해야 합니다

• 샘플 배송: 샘플은 아지드산나트륨과 함께 PBS에 넣어 배송해야 합니다.

신경계 질환 모델에서 미세아교세포 반응성에 대한 간략한 개요와 엄격한 정량적 분석이 중요한 이유.

미세아교세포는 지속적인 실질 감시, 면역 감지, 엄격하게 조절된 식세포 제거를 통해 조직 항상성을 유지합니다. 질병이 발생하면 미세아교세포는 선택적 신경세포의 취약성과 시냅스 및 회로 수준의 기능 장애의 출현에 따라 지역적으로 패턴화되고 단계에 따라 이질적인 활성화 상태로 전환됩니다. 이러한 상태 변화는 소체 비대와 더 짧고, 더 두껍고, 더 많은 분지 과정을 포함한정량화 가능한 형태학적 리모델링에의해 반영됩니다 .

기능적으로, 미세아교세포는 감시자 상태에서 즉, 주로 항상성을 감지하고 유지하는 역할에서 염증 신호, 산화 메커니즘, 보체 캐스케이드, 리소좀 결합 식세포 작용을 통해 국소 미세 환경을 적극적으로 수정하는 정의된 반응 프로그램을 실행하는 역할로 전환합니다.

이러한 구조적 변화에는 일반적으로 다음이 동반됩니다:

• 전 염증성 사이토카인 및 케모카인의 생산 및 방출 증가

• 활성 산소 및 질소 종 생성

• 보체 관련 프로그램

• 식세포 및 식세포 부하 증가

정상 및 병리학적인 조건에서 미세아교세포는 시냅스 가지치기 및 발달(Paolicelli, 2011; Schafer, 2012) 및 축삭 유도(Squarzoni, 2014 )와 같은 다양한 목적을 위해뉴런과 직접 상호 작용합니다. 최근에는 체세포 퓨린성 접합이라고 불리는 미세아교세포 과정과 신경세포 체세포 사이의 특수 부위가 신경세포 건강의 미세아교세포 감지를 위한 핵심 부위로 제안되었습니다(Cserép, 2020, 2021). 이 부위는 신경세포 쪽에서는 미토콘드리아, 미세아교세포 쪽에서는 퓨린성 수용체 P2Y12R과 연관되어 있는 것으로 밝혀졌습니다. 신경 퇴행성 질환에서 신체 접합부의 역할은 아직 밝혀지지 않았지만, 급성 뇌 손상 모델에서의 상호작용 빈도 증가(Cserép, 2020), 이러한 조건에서의 미토콘드리아 기능 장애, 파킨슨병 마우스 모델에서 이러한 상호작용과 신경 퇴화 사이의 강력한 상관관계를 보여주는 Biospective의 연구 등 여러 증거에 따르면 신체 접합부가 변경될 수 있음을 시사하고 있습니다.

활성화된 미세아교세포를 분류하는 방법에 대한 요약입니다.

분석 방법론 개요

• 컴퓨터 비전과 딥러닝 접근법을 사용해 전체 슬라이드 이미지에서 세포를 감지하고 분할합니다.

• 그런 다음 소마 영역, 프로세스의 분기점 수 등과 같은 형태학적 특징이 추출됩니다.

• 이러한 특징을 바탕으로 세포는 활성화 여부로 분류되고 머신 러닝 모델에 의해 연속적인 활성화 점수가 할당됩니다.

• 그런 다음 이러한 메트릭은 통계 분석을 위해 신경해부학적 관심 영역(ROI), 피험자 및 그룹별로 집계됩니다.

활성화된 미세아교세포 분석의 가치는 무엇인가요?

• 단순히 Iba1 염색 밀도를 정량화하는 것보다 더 큰 효과 크기. 알츠하이머병과 파킨슨병의 마우스 모델과 같은 다양한 맥락에서 바이오스펙티브는 Iba1 염색 밀도를 측정하는 것보다 미세아교세포 형태학적 분석을 사용한 그룹 비교에서 더 큰 효과 크기를 관찰했습니다. 전임상 유효성 연구의 맥락에서 이 결과는 코호트 규모가 작아도 동일한 약물 효과를 감지할 수 있다는 것을 의미합니다.

• 번역 관련 임상 지표와 상관관계가 있습니다. 미세아교세포 형태학적 분석은 운동 점수 및 MRI 뇌 용적과 같은 중개 관련 임상 지표와 강력한 상관관계를 보여줌으로써 추정 치료제의 효과에 대한 귀중한 인사이트를 제공합니다.

세포 간 상호작용을 정량화하는 방법에 대한 요약과 TDP-43 루게릭병 마우스 모델의 예시입니다.

뉴런과 미세아교세포 사이의 직접적인 상호작용을 분석하기 위해 얇은 조직 섹션에서 미세아교세포(예: Iba1) 및 신경세포(예: NeuN) 마커를 포함한 멀티플렉스 면역 형광을 수행합니다. Biospective의 플랫폼은 각 상호 작용의 특성을 자동으로 식별하고 정량화합니다:

• 크기: 중첩 면적, 세포 주변이 차지하는 비율 등.

• 유형/소세포 위치: 소마-소마 또는 미세아교세포-신경세포 간 소마 등

그런 다음 통계 분석을 위해 신경 해부학적 영역, 피험자 및 그룹별로 집계 통계(예: 프로세스-소마 상호작용을 하는 미세아교세포의 비율)를 계산할 수 있습니다.

워크플로우를 설명하기 위해 이 이미지 처리 및 분석 파이프라인을 Biospective에서 개발한 새로운 TDP-43 단백질 병증 마우스 모델의 뇌에서 얻은 mIF 이미지에 적용했습니다. 비형질전환, 야생형(WT) C57BL/6 마우스에 AAV-hTDP43ΔNLS(또는 대조군으로 AAV-null)를 흑질 실질(SNc)에 일방적으로 주입했습니다. 주사 후 6주 후에 뇌를 채취했습니다.

이 연구에서 대조군에 비해 AAV-hTDP43ΔNLS 그룹은 다음과 같은 특징을 보였습니다:

• 광범위한 미세아교세포증: 형태학적 분석을 통해 얻은 Iba1 염색 밀도와 활성화된 미세아교세포의 밀도가 크게 증가했습니다.

• 더 많은 미세아교세포와 뉴런의 상호 작용:

  • 뉴런의 더 많은 부분이 미세아교세포와 상호 작용했습니다.

  • 전체 미세아교세포의 수는 매우 증가했지만, 더 많은 수의 미세아교세포가 뉴런과 상호작용을 했습니다. 흥미롭게도 이 지표는 순수한 미세아교세포 기반 지표보다 통계적으로 더 강력한 의미를 가졌습니다.

  • 미세아교세포-프로세스-신경세포 간 소마 상호작용과 소마-소마 상호작용의 밀도가 모두 크게 증가했습니다.

• 상호작용이 더 커짐에 따라 상호작용의 성격에 변화가 생겼습니다.

• 이러한 상호작용은 병리에 대한 미세아교세포의 직접적인 반응으로 나타났는데, 개별 세포 내에서 병리학적 부담이 클수록(hTDP43/pTDP43 마커로 측정) 이러한 세포가 상호작용을 할 가능성이 더 높았습니다.

• 따라서 이러한 고급 지표는 전임상 치료 효능 연구에 매우 유용합니다. 민감도가 높을수록 동일한 코호트 규모를 사용하여 더 작은 효과 크기를 감지할 수 있다는 것을 의미합니다. 또한 이러한 지표는 신경세포 건강, 병리에 대한 치료 관련 미세아교세포 반응, 미세아교세포와 신경세포의 상호작용에 대한 상세한 인사이트를 제공합니다.

연구 결과의 인터랙티브 프레젠테이션

아래의 '이미지 인터랙티브'에서는 독자적인 유도성 TDP-43ΔNLS 모델에서 얻은 뇌의 고해상도 다중 면역 형광 조직 섹션을 포함한 미세아교세포-뉴런 상호작용 분석 결과를 확인할 수 있습니다 및 대조군 마우스를 포함합니다.

인터랙티브 뷰어 사용 방법
왼쪽 패널 또는 화면의 화살표를 통해 '이미지 스토리'를 탐색합니다. 마우스로 고해상도 현미경 이미지를 이동하고 스크롤 휠 또는 +/- 컨트롤을 사용하여 확대/축소할 수 있습니다. 제어판 (오른쪽 상단)에서 이미지 채널과 분할 오버레이를 전환할 수 있습니다. 최상의 경험을 위해 전체 화면 모드로 전환하는 것이 좋습니다. 이 대화형 프레젠테이션을 사용하면 현미경을 직접 내려다보는 것처럼 모델의 신경 병리 및 관련 기능 결손을 자세히 살펴볼 수 있습니다.

바이오스펙티브의 미세아교세포 염색 및 분석 서비스의 주요 이점:

• 고감도 미세아교세포 검출

• 맞춤형 항체/마커 염색을 포함한 미세아교세포 표현형 마커 염색(선택 사항)

• 높은 처리량의 자동화된 전체 슬라이드 이미징 및 신경해부학적 영역 분석

• 고유한 완전 자동화된 정량적 이미지 분석

  • 미세아교세포 형태 및 활성화 상태 분석

  • 미세아교세포-뉴런 상호작용

  • 공간적 근접성 분석(예: Aβ 플라크)

• 종 간(마우스, 쥐) 호환성

• 보완 서비스(예: 면역 분석을 통해 측정된 조직 및 체액 사이토카인 농도)

바이오스펙티브 플랫폼에서 제공하는 아밀로이드 플라크 환경 지표 선택

이 표는 바이오스펙티브 플랫폼에서 제공하는 다양한 정량적 미세아교세포 메트릭을 비교한 것입니다.

우리는 신경 퇴행성, 신경 근육 및 신경 염증성 질환에서 미세아교세포와 성상교세포가 수행하는 복잡한 역할을 조사하는 데 특히 중점을 둔 활발한 연구 및 혁신(R&I) 프로그램을 운영하고 있습니다.

바이오스펙티브는 신경 질환에서 신경염증이 수행하는 핵심적인 역할과 신경염증 반응의 표적 치료적 조절의 가치를 잘 알고 있습니다. 내부 연구 및 혁신 노력의 일환으로 질병 발병에 대한 신경염증의 관여를 더 잘 이해하기 위해 적극적으로 노력하고 있습니다. 현재 진행 중인 연구 활동은 다음과 같습니다:

• 신경염증과 신경퇴행 사이의 복잡한 관계를 탐구하는 원본 프레젠테이션 및 리소스 모음인 ' 미세아교세포, 성상세포 및 신경퇴행성 질환 이니셔티브(Microglia, Astrocytes, and Neurodegenerative Diseases Initiative )'.

• 루게릭병, 알츠하이머병, 파킨슨병, 타우병증, 다발성 경화증의 동물 모델에서 미세아교세포와 성상교세포를 분석합니다.

• 미세아교세포 및 성상세포의 표현형과 잘못 접힌 단백질(예: 아밀로이드-β, α-시누클레인, 타우, TDP-43), 뉴런 및 그 과정, 뇌 혈관, 말초 염증 등과의 공간적 관계를 특성화하는 새로운 방법을 개발합니다.

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자주 묻는 질문