Histologie et analyse d'images des microglies pour les modèles murins et rats

Coloration par immunofluorescence multiplex, segmentation, analyse morphologique et spatiale de la microglie dans des coupes de tissus provenant de modèles de rongeurs.

La microglie est un déterminant central de l'homéostasie du système nerveux central (SNC) et de la progression de la maladie dans les principales indications, y compris la maladie d'Alzheimer (MA) :

• La maladie d'Alzheimer (MA)

• Les démences liées à la tauopathie (par ex. DFT, CBD, PSP)

• La maladie de Parkinson (MP)

• La sclérose latérale amyotrophique (SLA)

• Sclérose en plaques (SEP)

L'analyse quantitative des caractéristiques microgliales, y compris la densité, la notation de l'état d'activation basée sur la morphologie et la topologie des contacts associés aux neurones, est essentielle pour mesurer la progression de la maladie et la réponse thérapeutique. Biospective a développé des flux de travailrobustes d'immunofluorescence multiplex (mIF) et de quantification automatisée de lames entières, optimisés pour le profilage du microenvironnement centré sur la pathologie et les points finaux d'interaction microglie-neurone dans les tissus du SNC des rongeurs.

Nos capacités de coloration de la microglie et d'analyse d'images

Quantification de la microgliose basée sur l'Iba1

• Quantification de la densité de la coloration Iba1 sur la lame entière et de la charge régionale dans des régions d'intérêt spécifiques, minimisant le biais d'échantillonnage et permettant des comparaisons à l'échelle de la cohorte.

Segmentation de la microglie et profil d'activation basé sur la morphologie

• Détection et classification de la microglie sur la totalité de la diapositive.

• Morphométrie à haut contenu extraite des cellules Iba1-positives et analysée avec des modèles d'apprentissage automatique entraînés et validés afin d'identifier les changements d'état subtils.

• Les résultats comprennent le remodelage de la taille et de la forme du soma, la longueur des processus et l'architecture des ramifications, ce qui permet une sous-classification objective basée sur la morphologie et une notation continue de l'état.

Phénotypage multiplexe aligné sur le mécanisme d'action

• Les panels de marqueurs d'état de la microglie combinés à Iba1 dans mIF, typiquement jusqu'à quatre cibles plus DAPI, optimisés pour le modèle de rongeur, le type de tissu et la stratégie de résultat. Les marqueurs peuvent être quantifiés en tant que densité de coloration dans les régions d'intérêt et dans les cellules segmentées pour obtenir des profils d'expression cellulaire. Les marqueurs courants sont les suivants

  • Identité et état homéostatique de la microglie : TMEM119, CD11b

  • Charge phagolysosomale et charge phagocytaire : LAMP1, CD68

  • Activation inflammatoire réactive et contexte immunitaire : CD45, TREM2

  • Contexte de la voie de l'effecteur : iNOS, composants du complément (par exemple C1q)

  • Engagement de l'inflammasome : ASC, caspase-1 clivée

  • Signalisation purinergique : P2RY12

Analyse de la pathologie et du microenvironnement

• Les marqueurs pathologiques et microenvironnementaux peuvent être intégrés pour quantifier la façon dont l'état microglial varie en fonction de la charge pathologique locale et de la proximité de foyers pathologiques définis, ce qui permet un phénotypage de niche résolu dans l'espace au sein des microenvironnements inflammatoires. Les canaux peuvent inclure

  • Modèles AD : Marqueurs de la plaque Aβ(amyloïde fibrillaire, 6E10/4G8, pFTAA) et marqueurs de la protéine tau(AT8, PHF1, MC1, p-Tau217, tau clivée N368/Asp412)

  • Modèles de SLA : phospho-TDP-43 (p409/410), TDP-43 humain, TDP-43 total

  • Modèles de SEP : marqueurs de l'intégrité de la myéline(par exemple MBP)

  • Marqueurs structurels et vasculaires : GFAP, laminine

• Les résultats comprennent le profilage de paramètres tels que la densité des taches et la morphologie microgliale en fonction de la distance par rapport à la pathologie, et la colocalisation de marqueurs spécifiques.

Quantification des interactions directes entre la microglie et les neurones

• En ajoutant un marqueur neuronal (par exemple NeuN), les contacts directs entre la microglie et les neurones peuvent être caractérisés.

• La taille de l'interaction et sa localisation (processus microglial au soma neuronal ou soma-soma) peuvent être quantifiées automatiquement.

Protocoles bien établis pour la préparation des échantillons de cerveau, la coloration, le balayage des lames et l'analyse quantitative des images.

Notre processus de coloration et d'analyse de la microglie

Chez Biospective, nous avons mis en place un processus standardisé et hautement reproductible en plusieurs étapes pour la coloration et l'analyse de la microglie à partir de cerveaux fixés au formol :

1. Préparation de l'échantillon

   • coupe microtomique de haute précision ou cryosectionnement de cerveaux FFPE ou fixés et congelés.

   • Protocoles de récupération d'antigènes personnalisés optimisés pour Iba1, NeuN et les marqueurs d'activation de la microglie, maximisant lesignal par rapport au fond pour permettre la détection des caractéristiques subtiles nécessaires à l'analyse quantitative de l'image. Les conditions de récupération sont également personnalisées pour tout anticorps supplémentaire inclus dans le panel multiplex. Nous effectuons régulièrement des récupérations à l'acide formique, des récupérations induites par la chaleur (HIER), des récupérations enzymatiques ou une combinaison de ces méthodes.

   • Contrôle rigoureux de la qualité et de la spécificité de la coloration ainsi que de l'intégrité des tissus.

2. Coloration (IHC ou IF multiplex)

   • Les panels de marqueurs sont configurés en fonction de l'analyse souhaitée, souvent en combinant :

     • Iba1 (microglie)

     • NeuN (soma neuronal ; lorsque des points finaux d'interaction cellule-cellule sont requis)

     • Pathologie pertinente pour le modèle de maladie(par exemple Aβ, p-tau, p-Syn129, phospho-TDP-43)

     • Marqueurs de l'état ou de la voie de la microglie(par exemple, CD68, TREM2, ASC)

     • DAPI (noyaux)

   • Avantages du multiplexage

     • Le multiplexage permet une analyse spécifique du type de cellule du microenvironnement sur une seule lame, caractérisant avec précision le paysage cellulaire entourant les plaques individuelles.

3. Imagerie

   • Balayage fluorescent multicanal de la section entière

4. Analyse quantitative
   Nous avons développé une analyse quantitative entièrement automatisée pour l'immunofluorescence multiplex :

   • Segmentation entièrement automatisée pour la microglie (Iba1), le soma neuronal (NeuN) et les marqueurs pathologiques pertinents pour le modèle

   • Rapport à haut débit, basé sur les régions, de la charge microgliale et des métriques d'état dérivées de la morphologie

   • Lorsque NeuN est inclus, l'analyse des contacts résout deux topologies d'interaction :

     • Contact processus microglial - soma neuronal

     • Lecontact entre le soma microglial et le soma neuronal, y compris la zone de contact quantitative.

Lignes directrices pour le prélèvement, la préparation et l'expédition des échantillons

Nous fournissons une assistance complète pour garantir l'intégrité des échantillons et la fiabilité des données :

• Collecte des échantillons : Les animaux doivent être perfusés avec du PBS froid et/ou du formol tamponné neutre à 10 %, et les cerveaux doivent être soigneusement extraits.

• Préparation des échantillons : Les cerveaux doivent être brièvement fixés dans du formol neutre à 10 %

• Expédition des échantillons : Les échantillons doivent être expédiés dans du PBS contenant de l'azoture de sodium.

Un bref aperçu de la réactivité microgliale dans les modèles de maladies neurologiques et des raisons pour lesquelles une analyse quantitative rigoureuse est essentielle.

La microglie maintient l'homéostasie tissulaire par une surveillance parenchymateuse continue, une détection immunitaire et une clairance phagocytaire étroitement régulée. En cas de maladie, la microglie passe à des états d'activation hétérogènes qui sont structurés au niveau régional et dépendent du stade, s'alignant sur la vulnérabilité sélective des neurones et l'émergence d'un dysfonctionnement au niveau des synapses et des circuits. Ces changements d'état sont reflétés par un remodelage morphologique quantifiable, y compris l'hypertrophie du soma et des processus plus courts, plus épais et plus ramifiés.

Sur le plan fonctionnel, la microglie passe d'un état de surveillance à un état effecteur, c'est-à-dire qu'elle passe de la détection et du maintien de l'homéostasie à l'exécution de programmes de réponse définis qui modifient activement le microenvironnement local, par le biais de la signalisation inflammatoire, des mécanismes oxydatifs, des cascades du complément et de la phagocytose couplée au lysosome.

Ces changements structurels s'accompagnent généralement

• Une augmentation de la production et de la libération de cytokines et de chimiokines pro-inflammatoires

• Génération d'espèces réactives de l'oxygène et de l'azote

• Programmes associés au complément

• Une charge phagolysosomale et phagocytaire élevée

Dans des conditions normales et pathologiques, la microglie interagit directement avec les neurones à des fins multiples, telles que l'élagage et le développement des synapses (Paolicelli, 2011; Schafer, 2012) et le guidage axonal (Squarzoni, 2014). Récemment, des sites spécialisés entre le processus microglial et le soma neuronal, appelés jonction purinergique somatique, ont été proposés comme étant un site clé pour la détection microgliale de la santé neuronale (Cserép, 2020, 2021). On a constaté que ces sites étaient associés aux mitochondries du côté neuronal et au récepteur purinergique P2Y12R du côté de la microglie. Bien que le rôle des jonctions somatiques dans les troubles neurodégénératifs reste largement inexploré, plusieurs éléments de preuve suggèrent qu'elles pourraient être altérées, notamment une augmentation de la fréquence des interactions dans un modèle de lésion cérébrale aiguë (Cserép, 2020), un dysfonctionnement mitochondrial dans ces conditions et l'étude de Biospective montrant une forte corrélation entre ces interactions et la neurodégénérescence dans un modèle murin de la maladie de Parkinson.

Résumé de nos méthodes de classification de la microglie activée.

Aperçu de la méthodologie d'analyse

• Les cellules sont détectées et segmentées sur des images de lames entières à l'aide d'approches de vision artificielle et d'apprentissage profond.

• Des caractéristiques morphologiques telles que la zone du soma, le nombre de points de ramification dans les processus, etc. sont ensuite extraites.

• Sur la base de ces caractéristiques, les cellules sont classées comme activées ou non et se voient attribuer un score d'activation continu par un modèle d'apprentissage automatique.

• Ces mesures sont ensuite agrégées par région d'intérêt neuroanatomique (ROI), par sujet et par groupe à des fins d'analyse statistique.

Quelle est la valeur de l'analyse de la microglie activée ?

• L'effet est plus important que la simple quantification de la densité de la coloration Iba1. Dans de multiples contextes, tels que les modèles murins de la maladie d 'Alzheimer et de la maladie de Parkinson, Biospective a observé une taille d'effet plus importante dans les comparaisons de groupes en utilisant l'analyse morphologique microgliale qu'en mesurant la densité de la coloration Iba1. Dans le contexte d'une étude d'efficacité préclinique, ce résultat signifie que le même effet médicamenteux serait détectable avec une cohorte plus petite.

• Corrélation avec des paramètres cliniques pertinents sur le plan de la traduction. Notre analyse morphologique de la microglie a montré une forte corrélation avec les paramètres cliniques pertinents pour la traduction, tels que les scores de motricité et le volume cérébral à l'IRM, ce qui en fait un aperçu précieux des effets d'une thérapeutique potentielle.

Un résumé de nos méthodes de quantification des interactions cellule-cellule et un exemple illustratif tiré d'un modèle de souris TDP-43 ALS.

Afin d'analyser les interactions directes entre les neurones et la microglie, nous réalisons une immunofluorescence multiplex incluant des marqueurs microgliaux(par exemple Iba1) et neuronaux(par exemple NeuN) dans des coupes de tissus minces. La plateforme de Biospective identifie et quantifie automatiquement les propriétés de chaque interaction :

• Taille : zone de chevauchement, fraction du périmètre cellulaire couverte, etc.

• Type/localisation subcellulaire : soma-soma ou processus microglial à soma neuronal

Les statistiques globales(par exemple, la fraction de microglies ayant des interactions processus-soma) peuvent ensuite être calculées par région neuroanatomique, par sujet et par groupe en vue d'une analyse statistique.

Pour illustrer notre flux de travail, nous avons appliqué ce pipeline de traitement et d'analyse d'images aux images mIF provenant des cerveaux d'un nouveau modèle de souris protéinopathes TDP-43 développé par Biospective. Des souris C57BL/6 non transgéniques de type sauvage (WT) ont reçu une injection unilatérale d'AAV-hTDP43ΔNLS (ou d'AAV-null comme contrôle) dans la substantia nigra pars compacta (SNc). Les cerveaux ont été prélevés 6 semaines après l'injection.

Dans cette étude, nous avons constaté que, par rapport aux témoins, le groupe AAV-hTDP43ΔNLS présentait les caractéristiques suivantes :

• Une microgliose étendue, avec une forte augmentation de la densité de la coloration Iba1 et de la densité de la microglie activée obtenue à partir de l'analyse morphologique.

• Plus d'interactions microglie-neurone :

  • Une plus grande fraction de neurones a eu des interactions avec la microglie.

  • Même si le nombre total de microglies a fortement augmenté, une plus grande fraction de microglies a eu des interactions avec les neurones. Il est intéressant de noter que cette mesure a une signification statistique plus forte que les mesures basées sur la microglie pure.

  • Une forte augmentation de la densité des interactions entre la microglie et le soma neuronal et des interactions entre le soma et le soma.

• Un changement dans la nature des interactions, celles-ci étant plus importantes.

• Ces interactions semblent être une réponse microgliale directe à la pathologie : plus la charge pathologique est importante dans les cellules individuelles (mesurée par les marqueurs hTDP43/pTDP43), plus ces cellules sont susceptibles d'avoir une interaction.

• Ces mesures avancées sont donc très utiles pour les études précliniques d'efficacité thérapeutique. La sensibilité plus élevée signifie qu'une taille d'effet plus petite serait détectée en utilisant la même taille de cohorte. En outre, ces mesures offrent un aperçu détaillé de la santé neuronale, des réponses microgliales à la pathologie liées au traitement et des interactions microglie-neurone.

Présentation interactive de notre étude de recherche

Dans l'image interactive ci-dessous, vous trouverez les résultats de notre analyse des interactions entre la microglie et les neurones, y compris des coupes de tissus par immunofluorescence multiplex à haute résolution de cerveaux provenant de notre modèle TDP-43ΔNLS inductible breveté et de souris témoins.

Comment utiliser notre visionneuse interactive
Naviguez dans l'"histoire de l'image" à l'aide du panneau de gauche ou des flèches à l'écran. Vous pouvez effectuer un panoramique sur les images de microscopie à haute résolution à l'aide de votre souris et effectuer un zoom avant/arrière à l'aide de la molette de défilement ou des commandes +/-. Le panneau de contrôle (en haut à droite) permet de basculer entre les canaux d'images et les superpositions de segmentation. Pour une expérience optimale, nous vous recommandons de passer en mode plein écran. Cette présentation interactive vous permet d'explorer en détail la neuropathologie du modèle et les déficits fonctionnels qui y sont associés, comme si vous regardiez directement au microscope.

Principaux avantages des services de coloration et d'analyse de la microglie de Biospective :

• Détection de la microglie à haute sensibilité

• Coloration optionnelle avec des marqueurs du phénotype microglial, y compris coloration personnalisée d'anticorps/marqueurs

• Imagerie automatisée à haut débit de la lame entière et analyse des régions neuroanatomiques

• Analyse quantitative unique et entièrement automatisée des images

  • Morphologie microgliale et états d'activation

  • Interactions microglie-neurone

  • Analyse de la proximité spatiale(p. ex. plaques Aβ)

• Compatibilité inter-espèces (souris, rat)

• Services complémentaires(p. ex. concentrations de cytokines dans les tissus et les fluides mesurées par immunodosage)

Sélection de mesures de l'environnement de la plaque amyloïde fournies par la plateforme de Biospective

Ce tableau compare les différentes métriques microgliales quantitatives fournies par la plateforme de Biospective.

Nous avons un programme actif de recherche et d'innovation (R&I) avec un accent particulier sur l'interrogation des rôles complexes que la microglie et les astrocytes jouent dans les maladies neurodégénératives, neuromusculaires et neuroinflammatoires.

Chez Biospective, nous reconnaissons le rôle clé que joue la neuroinflammation dans les maladies neurologiques et la valeur de la modulation thérapeutique ciblée des réponses neuroinflammatoires. Dans le cadre de nos efforts internes de recherche et d'innovation, nous travaillons activement à mieux comprendre l'implication de la neuroinflammation dans la pathogenèse des maladies. Nos activités actuelles comprennent :

• Notre initiative sur la microglie, les astrocytes et les maladies neurodégénératives - une collection de présentations originales et de ressources interrogeant la relation complexe entre la neuroinflammation et la neurodégénérescence.

• Analyse de la microglie et des astrocytes dans nos modèles animaux de la SLA, de la maladie d'Alzheimer, de la maladie de Parkinson, des tauopathies et de la sclérose en plaques.

• Développement de nouvelles méthodes pour caractériser les phénotypes de la microglie et des astrocytes, ainsi que leurs relations spatiales avec les protéines mal repliées(par exemple amyloïde-β, α-synucléine, tau, TDP-43), les neurones et leurs processus, la vascularisation cérébrale, l'inflammation périphérique, etc.

Pour discuter des exigences de votre étude ou demander un devis pour les services de coloration de la microglie et d'analyse d'images :

FAQ