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最后更新日期: 2024年8月06日
作者: Laurent Potvin-Trottier, Ph.D. and Barry J. Bedell, M.D., Ph.D.

本资源描述：

为什么要量化小胶质细胞形态？

小胶质细胞在许多神经退行性疾病中发挥着关键作用，包括肌萎缩侧索硬化症（ALS）、阿尔茨海默氏症（AD）和帕金森氏症（PD）（Salter，2017 ；Hickman，2018）。许多针对神经退行性疾病的潜在疗法都以小胶质细胞为目标，例如通过调节其表型或促进Aβ斑块的清除（Gao，2023）。单细胞‘组学技术表明，小胶质细胞是高度动态的细胞，能够呈现多种表型。最近，大约一百名科学家共同撰写了一篇论文（Paolicelli，2022），旨在澄清这些表型的术语并达成共识，使用的术语包括稳态特征、白质相关小胶质细胞和疾病相关小胶质细胞（DAM）。

在反应性条件下，小胶质细胞也会发生剧烈的形态变化。在此资源中，我们重点介绍了常用的定量形态表型（Savage，2020）。在稳态条件下，小胶质细胞通常表现为分支状形态，其特征是细长、延伸的突起。肥厚型小胶质细胞通常与反应性条件有关，其体细胞增大，突起更短、更粗、更分支。变形虫状小胶质细胞具有扩大的体细胞，几乎没有任何突起，在形态上与巨噬细胞相似。营养不良小胶质细胞突起的球状突起呈串珠状，可能看起来支离破碎。最后，棒状细胞 高度拉长 ，只有一个方向，几乎没有放射状突起。虽然功能表型和独特形态是小胶质细胞的两种互补特征，但形态变化（分支）和功能（细胞因子释放）之间的机制联系已经得到确认（Madry，2018）。此外，形态指标与单个小胶质细胞的功能标记相关（Kozlowski，2012 ；Fernández-Arjona，2019）。

显微镜图像和四种小胶质细胞形态的示意图。

小胶质细胞四种形态的显微图像和示意图示例。图片改编自（Reddaway，2023），基于（Savage，2019）中的形态学定义，遵循知识共享署名许可协议。

在Biospective，我们假设微胶质细胞形态的高通量定量分析可以提高对临床前研究中微胶质细胞状态的认知。在阿尔茨海默氏症 、帕金森氏症 和肌萎缩侧索硬化症的小鼠模型中，我们发现分析微胶质细胞形态比简单地通过Iba-1染色密度测量微胶质细胞病变，能够提供更敏感的疾病状态指标。

我们如何量化组织切片中的小胶质细胞形态？

实验条件：染色、切片厚度和显微镜
为了量化小胶质细胞形态，需要用一种对细胞突起和细胞体都特异且敏感的染色剂对小胶质细胞进行标记，且该染色剂在所有表型中均能表达（通常为Iba-1）。厚度达150µm的组织切片可用共聚焦显微镜进行z-stack成像，以对小胶质细胞形态进行完整的3D表征。对于二维高通量定量分析，可以使用数字切片扫描仪（Franco-Bocanegra，2021 ；Leyh，2021）对较薄的切片（5-20微米）进行成像。吞吐量和三维成像之间的权衡取决于研究目标。例如，高通量的二维成像适用于临床前治疗功效研究，并可扩展到数百万个细胞。在反应条件下，诸如体细胞大小之类的简单指标会不断变化（Kozlowski，2012 ；Verdonk，2016 ；Davis，2017 ；Fletcher，2020 ；Silburt，2022），但可以在二维空间中精确量化。例如，一项研究只关注体细胞形态，发现老年小鼠视网膜中的小胶质细胞从分支状转变为肥厚状（Choi，2022）。

形态学量化的步骤
下图描述了大多数方法中常见的自动量化的必要步骤。Reddaway等人（Reddaway，2023）对各种方法进行了回顾。首先，需要单独检测并分离小胶质细胞——这是计算机视觉中的目标检测任务。从背景中分离出每个细胞的细胞和体。通过算法获得细胞过程的骨架。最后，测量每个细胞的不同形态学指标（即形态计量学），例如细胞面积、周长、体面积、骨架分支数量等。

小胶质细胞形态分析过程的示意图。小胶质细胞可通过免疫组织化学（此处显示为Iba-1染色）或免疫荧光组织切片进行识别。对每个被识别的细胞，其细胞体和突起被分割，并得到突起的骨架。然后得到许多形态学指标，如细胞和细胞体的大小。然后，可以使用机器学习模型将细胞分类为特定形态。在示例中，蓝色框表示分支形态，红色框表示非分支形态。然后，可以根据感兴趣区域（ROI）、受试者（例如动物）和组来汇总有关细胞的统计信息。形态学指标示意图根据知识共享署名许可协议改编自（Leyh，2021 ）。

组间定量分析
细胞形态计量学数据按感兴趣区域（ROI）、动物和组进行汇总。比较组间差异主要有三种方法：

1.比较群体形态分布。最简单的方法 是直接比较特定指标（如体形大小）在群体中的分布。例如：（Kozlowski，2012； Heindl，2018）。

 

2.比较不同群集中的细胞分布。 机器学习方法可以识别形态相似的细胞群集。然后可以比较这些群集中的细胞在不同群集中的分布。例如：（Fernández-Arjona，2017 ；Heindl，2018 ；Salamanca，2019）。

 

3.比较不同分类形态的细胞分布。机器学习模型可以被训练来识别用户指定的形态（例如分支、肥大、变形等）。然后，可以比较不同组中具有这些形态的细胞的分布和数量。例如：（Leyh，2021 ；Choi，2022）。

在神经退行性疾病中，小胶质细胞形态发生了哪些变化？

在本节中，我们将重点介绍三种神经退行性疾病（ALS、AD和PD）的常见发现。

肌萎缩侧索硬化症（ALS）
在三种不同的ALS小鼠模型中，都观察到了小胶质细胞的形态变化。在SOD1-G93A模型中，在疾病进展期间观察到逐渐转变为类似于肥大的形态（更大的细胞体，更短的突起）（Ohgomori，2016）。在诱导性hTDP43ΔNLS模型中，在停止表达病理性TDP-43后，在疾病“恢复”期间观察到了类似的转变（Spiller，2018）。在C9orf72模型（GA-重复）中，观察到小胶质细胞数量增加并出现向肥大的转变。当小鼠对GA重复序列进行免疫时，这种效应基本消除（Zhou，2020）。在Biospective，我们使用TDP-43 ΔNLS小鼠模型，发现在“Off Dox”和“Low Dox”模型中，形态都发生了变化。非分支小胶质细胞的密度与临床综合运动评分高度相关。

在小鼠TDP-43 ΔNLS模型中，小胶质细胞形态变化与临床运动评分高度相关。

在小鼠TDP-43 ΔNLS模型中，小胶质细胞形态变化与临床运动评分高度相关。复合运动评分显示为Iba-1染色密度（分割像素的分数，左）和尾状核（CP）中具有非分支（“反应性”）形态的小胶质细胞密度（右）的函数，这些小胶质细胞在不同疾病严重程度组中。图中显示了x轴对数的线性拟合，皮尔逊相关系数从Iba-1染色密度的0.38增加到非分支小胶质细胞的密度的0.83。线性拟合中显示了不同的疾病严重程度组，例如“On Dox（对照）”、“4 weeks Low Dox”、“6 weeks Low Dox”和“3 weeks Off Dox”。四个ROI（尾状核、运动皮层、非运动皮层和皮质脊髓束）中非分支小胶质细胞的线性拟合的log-密度相关系数为0.93 +/- 0.06（范围从5倍交叉验证的标准偏差获得）。

阿尔茨海默氏病
人体组织研究通常表明，与年龄相当的对照组相比，阿尔茨海默氏病的小胶质细胞总数没有明显变化（Davies，2017；Heindl，2018 ；Paasila，2019 ；Martini，2020 ；Franco-Bocanegra，2021）。然而，人们观察到小胶质细胞形态发生了从稳态分支形态向营养不良形态的转变。有报告称，营养不良型小胶质细胞的数量有所增加（Bachstetter，2015 ；Davies，2017 ；Martini，2020）。多项形态学指标（例如总进程长度）与Aβ和/或tau病理负荷相关（Heindl，2018 ；Paasila，2019 ；Franco-Bocanegra，2021）。有趣的是，Franco-Bocanegra等人（Franco-Bocanegra，2021）观察到了一种治疗效果——与未经治疗的AD患者和健康对照组相比，针对Aβ42免疫的患者具有分支形态的小胶质细胞比例增加。我们在APP/PS1 AD小鼠模型中发现，小胶质细胞形态发生了变化，高度聚集在Aβ斑块附近，在评估疾病进展时比Iba-1染色密度更敏感。

帕金森病和突触核蛋白病
在帕金森病的大鼠和狨猴模型中，观察到从分支形态向肥大变形和变形虫形态的转变（Sanchez-Guajardo，2010 ；Barkholt，2012）。同样，在多系统萎缩（MSA；PLP-α-突触核蛋白）的小鼠模型中，观察到从分支形态向肥大形态的转变，但小胶质细胞总数并未增加（Refolo，2018）。在帕金森病大鼠模型中观察到了治疗效果——左旋多巴治疗组大鼠纹状体中出现了向肥大形态过渡的典型变化（体细胞体积、密度等增加），而盐水治疗组则没有（Fletcher，2020）。使用Biospective的PD小鼠模型（将人类前体纤维注射到半合子M83小鼠的前嗅核中），我们发现小胶质细胞总数增加，并朝着肥厚形态转变，这与疾病进展相关。与Iba-1染色密度相比，非分支小胶质细胞的密度是衡量疾病状态的更敏感指标。

我们的团队很乐意回答有关ALS、阿尔茨海默氏症和帕金森氏症中微胶质细胞形态学的任何问题，或提供有关我们用于疗效研究的模型的具体信息。

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帕金森病模型

常见问题解答

比较不同群体的不同定量方法有哪些优缺点？

使用机器学习对形态进行分类有哪些不同的方法？

是否通过微胶质细胞形态学分析观察到了治疗效果？

在小胶质细胞形态学中，还有哪些其他条件和疾病会导致其发生变化？

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