低剂量多西环素rNLS8（TDP-43ΔNLS）ALS小鼠模型中的肌肉炎性浸润

研究摘要： 通过对14只低多克西环素 （ Low Dox ）rNLS8（TDP-43ΔNLS） 小鼠和14只tTA对照小鼠 的腓肠肌进行 多重免疫荧光 染色 ， 并结合Biospective公司的PERMITS™图像分析技术 ，我们发现CD45⁺免疫细胞密度约为对照组的两倍， 该浸润细胞群主要由CD11b⁺髓系细胞组成；且在单只低多西环素小鼠中，CD45⁺细胞负荷越高，与之相关的神经肌肉接头去神经支配程度越完全（r = 0.81），而CMAP振幅则越低（r = −0.71）。 因此，肌肉炎症提供了一个定量且在机制上具有指导意义的终点指标，可在ALS临床前疗效研究中与神经肌肉接头（NMJ）神经支配和电生理学指标相辅相成。

研究概览：低剂量多西环素rNLS8小鼠的肌肉炎症与神经肌肉接头完整性（Biospective内部研究）。

骨骼肌炎症在肌萎缩侧索硬化症（ALS）中起着重要作用，因为在患者和实验鼠的肌肉中，免疫细胞会聚集在神经肌肉接头（NMJ）周围；且干预研究表明，这些细胞不仅会在运动神经末梢丧失后进行清理，还会加速其丧失（Wang，2017；Nógrádi，2025）。

肌萎缩侧索硬化症（ALS）在临床上的定义是上运动神经元和下运动神经元的退化，这会导致进行性肌无力、瘫痪，并最终导致呼吸衰竭（Hardiman, 2017）。几十年来，对该疾病的认识几乎完全围绕运动神经元细胞体展开。 时空病理学研究改变了这一观点：在SOD1突变小鼠中，早在腹侧神经根轴突或脊髓运动神经元丧失之前，终板去神经化就已经相当严重；而一例散发性ALS患者的尸检显示，在运动神经元看似完好的情况下，肌肉已出现去神经化（Fischer, 2004）。 神经肌肉接头去神经化也是TDP-43小鼠模型的一致特征，且已有研究提出TDP-43驱动型疾病存在“回溯性死亡”机制，这将神经肌肉接头及其周围的肌肉环境置于疾病发病机制的核心位置（Lépine, 2022;Alhindi, 2023）。

肌肉是积极的参与者，而非被动的靶点。

肌纤维、纤维-脂肪生成前体细胞、终末施万细胞和驻留免疫细胞都会对去神经化作出反应，其中一些反应会反过来影响神经肌肉接头的稳定性（Shefner，2023）。 在去神经支配的肌肉中，纤维-脂肪生成前体细胞会激活STAT3–IL-6信号通路，从而促进肌肉萎缩和纤维化；而阻断该通路可在SOD1小鼠中保护肌肉（Madaro, 2018）。NLRP3等炎性小体成分在 ALS 小鼠肌肉中也发生了改变，并已被作为肌肉来源的生物标志物进行研究（Moreno-García，2021）。

免疫细胞浸润聚集在突触丢失的部位。

在^SOD1G93A大鼠中，随着疾病进展，四肢肌肉中的髓系标志物（包括 CD11b 和 CD68）水平升高，同时伴随IL-1β和TNF-α水平升高，以及神经肌肉接头（NMJ）邻近区域出现反应性胶质细胞变化（Van Dyke，2016）。 在SOD1小鼠中，补体C5a通过巨噬细胞表面的C5aR1受体介导信号传导，驱动巨噬细胞向肌肉募集；而敲除C5aR1既减少了巨噬细胞数量，又减轻了终板去神经化，同时改善了握力（Wang, 2017）。 在尸检中，肥大细胞和中性粒细胞也会浸润瘫痪大鼠的肌肉以及ALS患者的股四头肌，并在那里与运动终板相关联（Trias，2017；Trias，2018）。

这些证据大多来自SOD1模型。 目前与 TDP-43 相关最直接的数据来自一项研究：该研究在 ALS 患者的肌肉活检样本中发现了白细胞和巨噬细胞浸润，并在多个 TDP-43 小鼠模型中（从无症状阶段开始）复现了这一发现，并表明浸润细胞集中于神经肌肉接头（NMJ）丰富的肌肉区域 （Nógrádi，2025）。蛋白质组学分析以及hTDP-43小鼠和患者肌肉中神经肌肉接点周围CCL2表达细胞的富集现象，均指向CCL2–CCR2轴的作用， 且在hTDP-43小鼠中进行局部抗体治疗（使用CCL2中和抗体或非特异性IgG）可减少白细胞浸润并减轻神经肌肉接头的去神经化（Nógrádi, 2025）。

然而，免疫细胞并非一律有害。进展缓慢的SOD1小鼠会产生一种早期肌肉反应，其中浸润的巨噬细胞呈现出促进再生的表型，这种表型支持肌生成并维持CMAP（Margotta，2023）， 而在rNLS8模型中，一旦TDP-43表达被关闭，小胶质细胞对于实现完全的运动功能恢复是必不可少的（Spiller，2018）。因此，同时测定免疫浸润的程度和类型，对于解读某种疗法在肌肉中的作用至关重要。

Low Dox rNLS8 模型通过在神经元中表达具有缺陷核定位信号的人源 TDP-43，从而重现了 TDP-43 驱动的神经肌肉病理变化，这会导致细胞质中 TDP-43 积累、神经肌肉接头去神经化以及运动功能衰退（Walker，2015)。Biospective 的“低多克索”诱导模型与传统的“无多克索”模型相比，以更缓慢、更便于药物测试的节奏诱导出该表型（Biospective 内部表型鉴定）。

rNLS8小鼠为双基因小鼠： 将由神经丝重链（NEFH）启动子驱动的 tTA 品系与 tetO-hTDP-43ΔNLS 响应品系杂交，因此神经元中的转基因表达在多西环素存在时被抑制，在去除多西环素时被诱导（Walker, 2015）。 在最初的描述中，诱导会产生不溶性的磷酸化胞质TDP-43，导致内源性核TDP-43缺失、肌肉去神经支配、运动神经元丧失及进行性运动功能障碍；而在疾病发作后重新给予多西环素，可促使肌肉重新神经支配并恢复功能（Walker, 2015）。 这种可逆性使得该模型在探究某条信号通路是否具有疾病修饰作用方面具有非凡的价值。由于转基因由神经元启动子驱动，本页所述的肌肉表型极有可能是由神经元 TDP-43 病理变化下游引起的，而非源于肌肉组织中转基因本身的表达。 如需更全面地比较 TDP-43 与其他 ALS 小鼠模型，请参阅我们关于“用于药物发现的 ALS 模型”的指南，以及关于“用于 ALS 药物开发的 TDP-43ΔNLS (rNLS8) 小鼠”的资源。

Biospective 开发并表征了一种低剂量多西环素（“Low Dox”）诱导方案，该方案可将疾病进展速度从数周延缓至数月，从而扩大了治疗干预的时间窗口。 该模型的详细信息、我们的内部繁殖群以及全套经过验证的终点指标，均可在我们的rNLS8 TDP-43ΔNLS 小鼠模型页面上查阅。 Biospective此前基于该模型的数据（收录于我们的“神经肌肉接头去神经化”交互式演示文稿中）显示：SV2A与α-蝮蛇毒素的共定位消失、突触前结构简化、轴突投射减少，同时伴随握力下降、CMAP振幅降低，以及纵向CT成像显示的后肢肌肉进行性萎缩。 在Thy1驱动的hTDP-43过表达模型中，也独立证实了神经肌肉接头去神经化现象，该现象仅限于神经末梢，并与运动神经元丧失呈同步变化（Alhindi, 2023）。

在Low Dox处理的rNLS8腓肠肌中，CD45⁺免疫细胞分布于整个肌肉组织中，其密度明显高于tTA对照组。下方的交互式展示功能可让您以全分辨率查看该整切片多重免疫荧光数据，同时还能查看自动生成的神经肌肉接头（NMJ）神经支配分割图及定量结果。

本报告的编排方式是，每张显微镜图像都与它所对应的测量结果并列呈现：首先是神经肌肉接头（NMJ）的结构，接着是低剂量多西环素（Low Dox）处理组和对照组肌肉中的CD45⁺浸润细胞，然后是去神经化与肌纤维动作电位（CMAP）之间的相关性，最后是CD11b⁺髓系细胞成分。 下文将总结这些结果，并将其置于人类疾病和药物研发的背景下进行探讨。

利用五种标志物多重免疫荧光检测面板和Biospective公司的自动化PERMITS™图像分析系统，对固定冷冻的腓肠肌切片中的肌肉炎症和神经肌肉接头（NMJ）完整性进行了定量分析，其中在连续切片上进行了CD11b染色，并在同一组低剂量多克西环素（Low Dox）处理的动物中记录了肌纤维动作电位（CMAP）。

实验动物。

该研究将 14 只低剂量多西环素 (Low Dox) rNLS8 小鼠与 14 只 tTA 单转基因对照小鼠进行了比较，后者携带 NEFH-tTA 驱动基因，但不携带人类 TDP-43ΔNLS 响应转基因（Biospective 内部数据）。

多重免疫荧光面板。

• 突触前神经末梢：SV2A

• 运动轴突和末梢分支：βIII-微管蛋白

• 突触后乙酰胆碱受体：α-蝮蛇毒素 (α-BTX)

• 白细胞：CD45（泛免疫细胞标志物）

• 细胞核：DAPI

• 髓系细胞（连续切片）：CD11b

染色采用本实验室的自动化多重免疫荧光平台进行，并按照本实验室“神经肌肉接头（NMJ）染色与分析服务”页面所述的工作流程，使用载玻片扫描仪对整张切片进行数字化处理。

定量读数。

PERMITS™ 对每个通道进行了分割，并得出了 CD45⁺ 细胞密度（每平方毫米肌肉中的细胞数）、SV2A 信号与 α-BTX 重叠的百分比、突触前分支复杂度以及轴突投射总量。 随后，根据每个神经肌肉接头（NMJ）的 SV2A/α-BTX 重叠情况，将其分类为完全去神经化（0–20%）、部分神经支配（20–80%）或完全神经支配（80–100%）， 各分类的密度以终板/mm²表示（Biospective内部分类标准）。

电生理学与统计分析。

通过刺激坐骨神经，记录腓肠肌的最大复合肌肉动作电位（CMAP）振幅。 组间差异采用配对t检验进行检验，结果以均值 ± 标准误（SEM）表示；在低剂量多西环素（Low Dox）组内，CD45⁺密度与神经肌肉接头（NMJ）或CMAP指标之间的关系采用皮尔逊相关分析评估，每只动物记录一个数据点（Biospective内部分析）。

是的。低剂量多西环素（Low Dox）处理的rNLS8小鼠腓肠肌中的CD45⁺免疫细胞密度约为tTA对照组的两倍（p < 0.001；图1），这表明存在持续的白细胞浸润，而非基线免疫监视（Biospective内部数据）。

空间分布模式与细胞数量同样重要。在 tTA 对照组肌肉中，少量存在的 CD45⁺ 细胞主要位于肌纤维之间的间质空间，这符合健康骨骼肌中常驻免疫监视的预期。 在低剂量多西环素（Low Dox）处理的肌肉中，CD45⁺细胞分布于整个切片中，您可通过在 交互式演示中切换rNLS8和tTA切片的CD45通道来确认这一点 。 由于CD45可标记所有白细胞，该指标反映了总炎症负荷；细胞的具体类型则通过下文的CD11b数据进行识别（Biospective内部数据）。当免疫细胞相对于单个终板的具体位置至关重要时，我们的 空间生物学 分析可直接绘制该区域的分布图。

除了炎症浸润外，低剂量多西环素处理的rNLS8小鼠还表现出从完全有神经支配到完全无神经支配的肌神经接头（NMJ）的显著转变，其突触前结构复杂性降低，轴突投射数量也少于tTA对照组（均p < 0.0001；图2和图3； Biospective内部数据）。

当某个项目需要同时存在β-淀粉样蛋白和明确的神经退行性病变时，我们会运行一个基于相同ARTE10背景的β-淀粉样蛋白和Tau蛋白共病理模型；此外，我们更广泛的阿尔茨海默病模型组合还能涵盖相关问题。 我们的“小胶质细胞、星形胶质细胞与神经退行性疾病计划”汇总了胶质细胞终点指标背后的研究方法。

这些神经肌肉接头（NMJ）的变化再现了 我们在该模型中先前 关于NMJ去神经化研究中描述的去神经化表型 ，并提供了可供逐只动物比较炎症浸润情况的结构性参考指标（Biospective内部数据）。

是的。在14只低剂量多西环素处理的rNLS8小鼠中，CD45⁺细胞密度与完全去神经化的神经肌肉接头（NMJ）密度呈正相关（皮尔逊相关系数r = 0.81，p = 0.0004），并与CMAP最大振幅呈负相关（r = −0.71， p = 0.0047；图4；Biospective内部数据）。

这些是组内相关性：它们比较的是低多西环素组动物之间的差异，而非低多西环素组与对照组之间的差异。因此，这些结果表明，炎症负担反映了个体动物神经肌肉疾病的严重程度，而不仅仅是基因型的标志。 将相关系数平方（r² ≈ 0.66 和 0.50）后，CD45⁺ 密度在统计学上与完全去神经化的神经肌肉接头（NMJ）中约三分之二的动物间变异量以及 CMAP 振幅中约一半的变异量相关（Biospective 内部分析）。 将组织学免疫指标与功能性神经支配肌纤维的电生理读数联系起来，正是赋予这种浸润现象其功能意义的关键。

相关性并不能确定因果方向。免疫细胞可能是因去神经化而被招募来清除碎片，也可能促成了去神经化，或者两者兼而有之。 其他模型中的干预研究至少证实了其起到了促进作用：在 hTDP-43 小鼠中，局部抗体治疗在减少白细胞浸润的同时也减轻了神经肌肉接头的去神经化（Nógrádi，2025）；在 SOD1 小鼠中，敲除 C5aR1 基因减少了巨噬细胞募集和去神经化 （Wang，2017），而马西替尼在^SOD1G93A大鼠中减少了肌肉肥大细胞和巨噬细胞的浸润，并减轻了去神经化（Trias，2017）。 低剂量多西环素（Low Dox）模型因其病情进展较慢，非常适合用于验证TDP-43驱动型疾病的相同因果关系问题。

CD11b⁺ 髓系细胞（极有可能是巨噬细胞及相关髓系细胞）似乎构成了浸润细胞的主体，因为在紧邻CD45染色切片处的切片上，CD11b染色结果与低剂量多克西环素（Low Dox）处理肌肉中的CD45⁺ 分布高度一致，而在tTA对照组中则分布稀疏 （图5；Biospective内部数据）。

以髓系细胞为主的浸润现象，与ALS患者活检标本和TDP-43小鼠中报道的富含巨噬细胞的肌肉病理学表现一致（Nógrádi，2025），也与SOD1模型中巨噬细胞向去神经化肌肉募集的现象一致（Van Dyke，2016； Wang, 2017）中观察到的巨噬细胞向去神经支配肌肉募集的现象。以下三点局限性决定了这一观察结果的适用范围：

• 单核细胞、中性粒细胞和某些自然杀伤细胞也会表达CD11b，因此仅凭该标志物无法特异性识别巨噬细胞。

• 常规 T 细胞和 B 细胞中几乎不表达 CD11b，这可能对 CD45⁺ 细胞群有所贡献，且其具体数量尚待量化。

• 此处展示的CD11b比较仅为定性分析；每只动物的CD11b密度及其与去神经化之间的关系尚未进行定量分析。

若添加巨噬细胞标志物（F4/80 或 CD68）， 区分促炎与促再生状态的极化标志物、中性粒细胞的Ly6G、T细胞的CD3以及CCL2本身，将能解决这些问题（这与我们用于 脑组织小胶质细胞的形态学和表型分析工具包相同 ）， 这对结果的解读至关重要，因为促再生型巨噬细胞与疾病进展减缓相关（Margotta, 2023），而肥大细胞和中性粒细胞则被认为与运动神经元轴突变性有关（Trias, 2018）。

低剂量多西环素（Low Dox）rNLS8小鼠的肌肉表型与ALS患者的发现相吻合：ALS患者的肌肉在运动终板附近可见白细胞、巨噬细胞、肥大细胞和中性粒细胞浸润，同时伴有终板去神经化以及运动单位电生理指标的进行性丧失（Bruneteau，2015； Neuwirth, 2015; Trias, 2018; Nógrádi, 2025）。

Low Dox rNLS8小鼠的检测结果与人类ALS的观察结果或测量数据之间的对应关系。

TDP-43在肌肉免疫学中的作用。

几乎所有ALS患者体内都存在胞质TDP-43聚集物，而SOD1突变仅占病例中的一小部分（Hardiman, 2017;Lépine, 2022）。 然而，关于肌肉炎症机制的大部分文献均源自SOD1转基因啮齿类动物模型（Van Dyke, 2016;Trias, 2017;Wang, 2017）。 低剂量多西环素（Low Dox）rNLS8模型提供了一个由TDP-43驱动的研究环境，可在其中测定相同的免疫指标，从而补充了近期在其他TDP-43细胞系中的研究成果（Nógrádi, 2025）。

与临床相关的功能终点。

临床上记录的CMAP振幅采用与小鼠实验相同的原理，而在多中心ALS队列研究中，诸如运动单位数指数（MUNI）等衍生指标在数月内会出现可测量的下降，即使在临床尚未表现为肌无力的肌肉中也是如此（Neuwirth, 2015;Neuwirth, 2017）。 因此，将组织水平的免疫指标与 CMAP 相结合，可为赞助商提供一种临床前读数，该读数与 ALS 临床研究中已使用的电生理指标相对应。

免疫调节疗法已进入ALS临床试验阶段。

针对外周免疫系统的干预并非假设。马西替尼（Masitinib）是一种对肥大细胞和巨噬细胞具有活性的酪氨酸激酶抑制剂，它减少了 SOD1 啮齿类动物的肌肉免疫浸润和去神经化（Trias, 2017;Harrison & Rafuse, 2020），且据报道在某随机ALS试验的预先指定亚组中延缓了功能衰退（Mora, 2020）。调节外周巨噬细胞也延长了ALS小鼠的生存期（Chiot, 2020）。 一种具有可测定肌肉浸润特征的TDP-43模型，为在绝大多数患者共有的病理机制中验证此类作用机制提供了途径。

当肌肉炎症在同一实验动物中与神经肌肉接头（NMJ）神经支配和复合肌肉动作电位（CMAP）一同进行定量测定时，它既可作为免疫调节性肌萎缩侧索硬化症（ALS）治疗药物的作用机制和靶点结合终点，也可作为任何治疗类别的疾病严重程度衡量指标。

该终点可反映的机制。

• 趋化因子受体阻断，例如CCL2–CCR2轴（Nógrádi，2025）

• C5a–C5aR1 位点的补体抑制（Wang，2017）

• 作用于肥大细胞和巨噬细胞的酪氨酸激酶抑制剂（Trias, 2017；Harrison & Rafuse, 2020）

• 针对巨噬细胞的靶向递送，例如定位于活化肌肉巨噬细胞的树状大分子偶联物（Tallon，2022）

• 去神经化肌肉中的基质和细胞因子通路，例如成纤维-成脂前体细胞的STAT3–IL-6信号传导（Madaro，2018）

• 通过重编程外周巨噬细胞而非耗竭其数量的策略（Chiot, 2020）

一套综合的、基于同一动物的终点评估方案。

由于CD45⁺密度、神经肌肉接头（NMJ）神经支配类别、突触前复杂性及肌纤维动作电位（CMAP）均来自同一组小鼠，因此可直接验证药物诱导的浸润细胞减少是否对突触和肌肉功能产生下游益处，并能区分出通过炎症途径起作用的药物与不涉及炎症而挽救NMJ功能的药物。 这些检测指标可与该模型中已验证的握力、CT肌肉体积、血浆和脑脊液神经丝轻链（NfL）、MRI脑萎缩及脑组织病理学终点指标相结合，并可辅以细胞因子谱分析，具体内容详见我们的TDP-43ΔNLS模型页面。

炎症负担作为协变量。

由于在该队列中，CD45⁺密度占去神经化和CMAP（复合肌肉动作电位）动物间变异的大部分，因此在非免疫疗法研究中，它也可作为协变量或分层变量进行分析，有助于将真实的治疗效果与动物间疾病严重程度的差异区分开来（Biospective内部分析）。

我们与赞助商讨论的设计考量。

• 给药窗口与途径：采用我们任何给药途径，可选择从诱导期开始的预防性设计，或待去神经化确立后开始的干预性设计。

• 阳性对照：恢复多西环素可抑制转基因表达，并促进神经再支配和功能恢复，为疾病干预提供基准（Walker，2015）。

• 表型，而不仅仅是数量：广泛的髓系细胞抑制可能适得其反，因为在小鼠模型中，小胶质细胞支持恢复，且促进再生的巨噬细胞与疾病进展减缓相关（Spiller, 2018;Margotta, 2023），因此建议在免疫调节项目中使用极化标志物。

• 样本量：在我们此前基于该模型的神经肌肉接头（NMJ）数据集中，估计每组少于15只小鼠即可检测到SV2A–α-BTX重叠度的25%变化；针对CD45⁺终点的等效估计值可从本研究队列中推导得出（Biospective内部数据）。

研究资助方将获得整切片图像数据、每只动物的定量指标以及神经肌肉接头分类图，如需研究切片的交互式演示，可另行提出请求。

常见问题解答

相关内容