ALSの低用量ドキソルビシンrNLS8（TDP-43ΔNLS）マウスモデルにおける筋組織の炎症性浸潤

研究概要： 14匹のLow Dox rNLS8（TDP-43ΔNLS） マウスおよび14匹のtTA対照マウスの 腓腹筋について 、多重免疫蛍光 法およびBiospective社のPERMITS™画像解析 を用いた結果 、CD45⁺免疫細胞の密度は対照群の約2倍であることが判明した。 浸潤細胞は主にCD11b⁺骨髄系細胞であるようであり、個々のLow Doxマウスにおいて、CD45⁺細胞の負荷が高いほど、神経筋接合部の脱神経がより完全であること（r = 0.81）およびCMAP振幅が低いこと（r = −0.71）と強く関連していることが明らかになった。 したがって、筋炎症は、前臨床段階のALS有効性試験において、NMJの神経支配や電気生理学的所見を補完する、定量的かつメカニズムの解明に有益なエンドポイントを提供するものである。

研究の概要：低用量ドキソルビシン処理rNLS8マウスにおける筋炎症および神経筋接合部の健全性（Biospective社内研究）。

ALSにおいて骨格筋の炎症が重要なのは、患者や実験用げっ歯類の筋組織において、神経筋接合部（NMJ）周辺に免疫細胞が蓄積するためであり、介入研究によれば、これらの細胞は単に神経筋接合部の損傷後の清掃を行うだけでなく、運動神経終末の喪失を加速させる可能性があることが示されている（Wang, 2017;Nógrádi, 2025）。

筋萎縮性側索硬化症（ALS）は、臨床的には上運動ニューロンおよび下運動ニューロンの変性によって定義され、これによって進行性の筋力低下、麻痺、そして最終的には呼吸不全を引き起こす（Hardiman, 2017）。数十年にわたり、この疾患の理解はほぼ完全に運動ニューロンの細胞体に焦点を当てたものであった。 時空間的病理学的研究により、その見方は一変した。SOD1変異マウスでは、腹側根軸索や脊髄運動ニューロンが喪失される以前から、終板の脱神経がすでに著しく進行しており、散発性ALS患者の剖検では、運動ニューロンが外見上は正常であるにもかかわらず、筋肉の脱神経が認められた（Fischer, 2004）。 NMJの脱神経はTDP-43マウスモデルにおいても一貫した特徴であり、TDP-43に起因する疾患については「ダイイング・バック」メカニズムが提唱されており、NMJとその周囲の筋環境が疾患発症の中心に位置づけられている（Lépine, 2022;Alhindi, 2023）。

筋肉は受動的な標的ではなく、能動的な参加者である。

筋線維、線維脂肪前駆細胞、終末シュワン細胞、および常在免疫細胞はすべて、神経支配の喪失に反応し、これらの反応のいくつかは神経筋接合部の安定性にフィードバックしている（Shefner, 2023）。 脱神経された筋において、線維・脂肪分化前駆細胞は、萎縮と線維化を促進するSTAT3–IL-6シグナル伝達を活性化し、この経路を遮断することでSOD1マウスにおける筋組織が維持された（Madaro, 2018）。NLRP3などのインフラマソーム構成要素も、ALS マウスの筋肉で変化が見られ、筋肉由来のバイオマーカーとして研究が進められている（Moreno-García, 2021）。

免疫細胞の浸潤は、シナプスが失われた部位に集まる。

^{SOD1G93Aラット}では、疾患の進行に伴い、四肢の筋肉においてCD11bやCD68などの骨髄系マーカーが上昇し、それに伴ってIL-1β およびTNF-αの上昇、ならびに神経筋接合部（NMJ）に隣接する反応性グリアの変化が認められる（Van Dyke, 2016）。 SOD1マウスでは、マクロファージ上のC5aR1を介した補体C5aシグナル伝達が、マクロファージの筋組織への動員を促進しており、C5aR1を欠損させると、マクロファージの数と終板の脱神経がともに減少するとともに、握力が改善した（Wang, 2017）。 マスト細胞や好中球も、麻痺したラットの筋肉や、剖検時のALS患者の大腿四頭筋に浸潤しており、そこで運動終板と関連していることが確認されている（Trias, 2017;Trias, 2018）。

これらの証拠のほとんどは、SOD1モデルから得られたものである。 現在、TDP-43に関連する最も直接的なデータは、ALS患者の筋生検標本において白血球およびマクロファージの浸潤を同定し、症状発現前の段階から複数のTDP-43マウスモデルでこの所見を再現し、浸潤細胞が神経筋接合部（NMJ）が豊富な筋領域に集中していることを示した研究によるものである （Nógrádi, 2025）。hTDP-43マウスおよび患者の筋肉におけるプロテオミクス解析と、NMJ周辺でのCCL2発現細胞の富集は、CCL2–CCR2軸の関与を示唆しており、 また、hTDP-43マウスにおける局所抗体治療（CCL2中和抗体または非特異的IgGのいずれか）により、白血球の浸潤が抑制され、NMJの脱神経が軽減された（Nógrádi, 2025）。

しかし、免疫細胞がすべて有害というわけではない。進行の遅いSOD1マウスでは、浸潤したマクロファージが筋形成を促進し、CMAPを維持する再生促進型の表現型をとるという初期の筋反応が見られる（Margotta, 2023）。 また、rNLS8モデルでは、TDP-43の発現が停止した後、完全な運動機能の回復にはミクログリアが必要とされる（Spiller, 2018）。したがって、免疫浸潤の程度と構成を測定することは、治療法が筋肉内でどのような作用を及ぼしているかを解釈するために不可欠である。

Low Dox rNLS8モデルは、核局在シグナルに欠陥のあるヒトTDP-43をニューロンで発現させることで、TDP-43に起因する神経筋病変を再現する。これにより、細胞質内のTDP-43の蓄積、神経筋接合部（NMJ）の脱神経、および運動機能の低下が引き起こされる（Walker, 2015)。Biospective社のLow Dox誘導パラダイムは、従来のOff Doxパラダイムよりも緩やかな、かつ薬剤試験に適したペースでこの表現型を誘導する（Biospective社内部の特性評価）。

rNLS8マウスはバイジェニックである： ニューロフィラメント重鎖（NEFH）プロモーターによって駆動されるtTA系統と、tetO-hTDP-43ΔNLSレスポンダー系統を交配させたものであり、これにより、ニューロンにおけるトランスジーンの発現はドキシサイクリンによって抑制され、ドキシサイクリンを除去すると誘導される（Walker, 2015）。 当初の報告によれば、誘導により不溶性のリン酸化細胞質TDP-43の生成、内因性核内TDP-43の消失、筋脱神経、運動ニューロンの喪失、および進行性の運動機能障害が生じたが、疾患発症後にドキシサイクリンを再投与することで、筋再神経支配と機能回復が認められた（Walker, 2015）。 この可逆性により、本モデルは、ある経路が疾患修飾性であるかどうかを検証する上で極めて有用である。トランスジーンはニューロンプロモーターによって発現が制御されているため、本ページで記述されている筋の表現型は、筋組織自体におけるトランスジーンの発現によるものではなく、ニューロンにおけるTDP-43の病理変化の下流で生じている可能性が高い。 TDP-43およびその他のALSマウスモデルに関するより広範な比較については、創薬のためのALSモデルガイドおよびALS創薬向けTDP-43ΔNLS（rNLS8）マウスに関するリソースを参照してください。

Biospective社は、ドキシサイクリンの投与量を低減した（「Low Dox」）誘導パラダイムを開発・特性評価しました。これにより、疾患の進行が数週間から数ヶ月へと遅延し、治療が有効に作用しうる期間が拡大します。 このモデルの詳細、当社の社内繁殖コロニー、および検証済みのエンドポイントの全セットについては、rNLS8 TDP-43ΔNLSマウスモデルのページをご覧ください。 当社の「NMJ脱神経インタラクティブプレゼンテーション」で提示された、このモデルに関するBiospectiveの過去のデータでは、SV2Aとα-ブンガロトキシンの共局在の消失、シナプス前構造の単純化、軸索投射の減少に加え、握力の低下、CMAP振幅の低下、および縦断的CT画像における後肢筋の進行性萎縮が示されました。 NMJ脱神経は、Thy1駆動型hTDP-43過剰発現モデルにおいても独立して報告されており、そこでは神経終末に限定され、運動ニューロンの喪失と連動して進行することが確認されています（Alhindi, 2023）。

Low Dox rNLS8 腓腹筋では、CD45⁺ 免疫細胞が筋肉全体に分布しており、その密度は tTA 対照群に比べて明らかに高くなっています。以下のインタラクティブ・プレゼンテーションでは、この全切片マルチプレックス免疫蛍光データを、自動生成された神経筋接合部（NMJ）の神経支配セグメンテーションや定量結果とともに、フル解像度で確認することができます。

本発表では、各顕微鏡画像と、それに対応する測定結果を並べて提示しています。まずNMJの構造、次に低用量ドキシサイクリン処理群および対照群の筋組織におけるCD45⁺浸潤、脱神経およびCMAPとの相関、そして最後にCD11b⁺骨髄系細胞について取り上げます。 以下のセクションでは、これらの結果を要約し、ヒトの疾患および創薬の文脈に位置づけます。

固定・凍結した腓腹筋切片について、5マーカーの多重免疫蛍光パネルおよびBiospective社の自動画像解析システム「PERMITS™」を用いて、筋炎症および神経筋接合部（NMJ）の完全性を定量化した。また、同一のLow Dox群の動物において、連続切片でのCD11b染色およびCMAPの記録を行った。

動物。

本研究では、14匹のLow Dox rNLS8マウスと、NEFH-tTAドライバーを持つがヒトTDP-43ΔNLSレスポンダートランスジーンを持たない14匹のtTA単一トランスジェニック対照マウスを比較した（Biospective社内データ）。

多重免疫蛍光パネル。

• シナプス前神経終末：SV2A

• 運動軸索および終末枝：βIII-チューブリン

• シナプス後アセチルコリン受容体：α-ブンガロトキシン（α-BTX）

• 白血球：CD45（汎免疫細胞マーカー）

• 核：DAPI

• 骨髄系細胞（連続切片）：CD11b

染色は、当社の自動マルチプレックス免疫蛍光プラットフォームを用いて行い、NMJ染色および解析サービスページに記載されているワークフローに従い、スライドスキャナーで切片全体をデジタル化しました。

定量結果。

PERMITS™ により各チャンネルがセグメント化され、CD45⁺ 細胞密度（筋肉 1 mm² あたりの細胞数）、α-BTX と重なる SV2A シグナルの割合、シナプス前分枝の複雑さ、および軸索投射の総数が算出されました。 その後、各NMJは、SV2Aとα-BTXの重なり具合に基づき、完全脱神経（0～20%）、部分神経支配（20～80%）、完全神経支配（80～100%）に分類され、 各クラスの密度は、終板/mm²として表された（Biospective社独自の分類）。

電気生理学および統計解析。

坐骨神経刺激後の腓腹筋から、最大複合筋活動電位（CMAP）の振幅を記録した。 群間の差異は対応のないt検定を用いて検定し、平均値 ± SEMとして示した。CD45⁺密度とNMJまたはCMAPの測定値との関連性は、Low Dox群内でピアソンの相関分析を用いて評価し、1匹あたり1データ点を用いた（Biospective社内分析）。

はい。Low Dox rNLS8マウスの腓腹筋におけるCD45⁺免疫細胞の密度は、tTA対照群の約2倍であった（p < 0.001；図1）。これは、ベースライン時の免疫監視ではなく、持続的な白血球浸潤を示唆している（Biospective社内データ）。

空間的な分布パターンは、細胞数と同じくらい重要です。tTA対照筋では、存在する少数のCD45⁺細胞は、主に筋線維間の間質空間に位置しており、これは健康な骨格筋における常在性免疫監視として予想されるものです。 Low Dox筋では、CD45⁺細胞が切片全体に広がっており、これは インタラクティブプレゼンテーション内のrNLS8およびtTA切片でCD45チャンネルを切り替えることで確認できます 。 CD45はすべての白血球を標識するため、この測定値は総炎症負荷を捉えています。細胞の同定については、以下のCD11bデータ（Biospective社内データ）で扱われています。個々の終板に対する免疫細胞の位置が重要な場合、当社の 空間生物学 解析により、 その周辺領域を直接マッピングすることができます。

炎症性浸潤に加え、Low Dox rNLS8マウスでは、tTA対照群と比較して、完全に神経支配されている神経筋接合部（NMJ）から完全に脱神経されたNMJへの顕著な変化が認められ、シナプス前部の複雑性が低下し、軸索投射の数も減少していた（すべて p < 0.0001；図2および図3； Biospective社内部データ）。

アミロイドに加え、タウ病理および明らかな神経変性が求められるプログラムについては、同じARTE10系統を基盤としたアミロイドβおよびタウの共病理モデルを運用しており、より広範なアルツハイマー病モデルポートフォリオが関連する課題を網羅しています。 当研究所の「ミクログリア、アストロサイトおよび神経変性疾患イニシアチブ」では、グリア細胞のエンドポイントに関する方法論をまとめています。

これらの神経筋接合部（NMJ）の変化は 、このモデルを用いた我々の以前の NMJ脱神経研究で報告された脱神経表現型を再現する ものであり、個体ごとに炎症性浸潤を比較するための構造的指標となる（Biospective社内データ）。

はい。14匹のLow Dox rNLS8マウスにおいて、CD45⁺細胞密度は、完全に脱神経された神経筋接合部（NMJ）の密度と正の相関を示し（ピアソン相関係数 r = 0.81、p = 0.0004）、CMAPの最大振幅とは負の相関を示した（r = −0.71、 p = 0.0047；図4；Biospective社内データ）。

これらは群内相関であり、低ドキシサイクリン群の個体同士を比較したもので、低ドキシサイクリン群と対照群を比較したものではない。したがって、これらは炎症負荷が単に遺伝子型を示すのではなく、個々の動物における神経筋疾患の重症度と連動していることを示している。 係数を二乗すると（r² ≈ 0.66 および 0.50）、CD45⁺ 密度は、完全に脱神経された神経筋接合部（NMJ）における個体間の分散の約3分の2、およびCMAP振幅の分散の約半分と統計的に関連している（Biospective社内分析）。 組織学的な免疫指標を、機能的に神経支配されている筋線維の電気生理学的測定値と結びつけることこそが、浸潤に機能的な意味を与えるのである。

相関関係は因果関係を立証するものではない。免疫細胞は、脱神経によって生じた残骸を除去するために動員されている可能性もあれば、その残骸の形成に寄与している可能性もあり、あるいはその両方である可能性もある。 他のモデルにおける介入研究は、少なくとも寄与する役割があることを裏付けている。hTDP-43マウスにおいて、白血球の浸潤を減少させた局所抗体治療は、NMJの脱神経も軽減した（Nógrádi, 2025）。また、SOD1マウスにおいてC5aR1を欠損させると、マクロファージの動員と脱神経が減少した （Wang, 2017）、また、マシチニブ^はSOD1G93Aラットにおいて筋組織へのマスト細胞およびマクロファージの浸潤を減少させ、脱神経を軽減した（Trias, 2017）。 進行が緩やかなLow Doxモデルは、TDP-43に起因する疾患についても同様の因果関係を検証するのに適している。

CD11b⁺骨髄系細胞（おそらくマクロファージおよび関連する骨髄系細胞）が浸潤細胞の大部分を占めているようである。というのも、CD45染色切片に隣接する切片におけるCD11b染色の分布は、Low Dox群の筋組織におけるCD45⁺細胞の分布とほぼ一致していたのに対し、tTA対照群ではその分布がまばらであったからである （図5；Biospective社内データ）。

主に骨髄系細胞による浸潤は、ALS患者の生検標本やTDP-43マウスで報告されているマクロファージが豊富な筋病理（Nógrádi, 2025）や、SOD1モデルにおける脱神経筋へのマクロファージの動員（Van Dyke, 2016; Wang, 2017）における脱神経筋へのマクロファージの動員とも一致している。この知見をどこまで一般化できるかについては、以下の3つの制限事項が考慮される必要がある：

• CD11bは単球、好中球、および一部のナチュラルキラー細胞にも発現しているため、これだけではマクロファージを特定することはできない。

• CD11bは通常のTリンパ球およびBリンパ球にはほとんど発現しておらず、これらがCD45⁺集団に寄与している可能性があり、その定量化は今後の課題である。

• ここで示したCD11bの比較は定性的なものであり、個体ごとのCD11b密度および脱神経との関連性については、まだ定量化されていない。

マクロファージマーカー（F4/80またはCD68）に加え、 炎症促進状態と再生促進状態を区別する分極マーカー、好中球のLy6G、T細胞のCD3、およびCCL2自体を追加することで、これらの疑問は解消されるだろう（これは 、脳組織のミクログリアに適用しているのと同じ形態学的および表現型解析ツールキットである ）。 また、再生促進性のマクロファージは病状の進行が遅いことに関連している（Margotta, 2023）一方で、マスト細胞や好中球は運動神経軸索の変性と関連している（Trias, 2018）ことが示唆されているため、これらの知見は解釈上重要である。

Low Dox rNLS8マウスの筋フェノタイプは、ALS患者に見られる所見と類似している。ALS患者の筋肉では、運動終板付近に白血球、マクロファージ、マスト細胞、好中球の浸潤が認められるほか、終板の脱神経および運動単位の電気生理学的指標の進行性低下が観察される（Bruneteau, 2015; Neuwirth, 2015; Trias, 2018; Nógrádi, 2025）。

Low Dox rNLS8マウスにおける測定結果と、ヒトのALSにおける所見や測定値との対応関係。

筋免疫学におけるTDP-43の関連性。

ALS患者のほぼ全員に細胞質内のTDP-43凝集体が認められる一方で、SOD1変異が関与する症例はごく一部に過ぎない（Hardiman, 2017;Lépine, 2022）。 しかし、筋炎症に関するメカニズムに関する文献の多くは、SOD1変異を持つげっ歯類を用いた研究に基づいている（Van Dyke, 2016;Trias, 2017;Wang, 2017）。 Low Dox rNLS8 モデルは、TDP-43 が関与する環境を提供し、そこで同様の免疫指標を測定することができるため、他の TDP-43 系統における最近の研究を補完するものです（Nógrádi, 2025）。

臨床と整合した機能的エンドポイント。

CMAPの振幅は、マウスで用いられているのと同じ原理で臨床現場でも記録されており、多施設共同のALSコホートでは、臨床的にまだ筋力低下が見られない筋肉であっても、運動単位数指数（Motor Unit Number Index）などの派生指標が数か月の間に測定可能なほど低下することが示されている（Neuwirth, 2015;Neuwirth, 2017）。 したがって、組織レベルの免疫指標を CMAP と組み合わせることで、スポンサーは、ALS の臨床研究ですでに使用されている電気生理学的指標と対応付けられる前臨床的な測定値を得ることができます。

免疫調節療法は、すでにALSの臨床試験の段階に達している。

末梢免疫系を標的とするアプローチは、単なる仮説ではない。マスト細胞やマクロファージに作用するチロシンキナーゼ阻害剤であるマシチニブは、SOD1変異を有する齧歯類において、筋肉への免疫細胞の浸潤および脱神経を軽減した（Trias, 2017;Harrison & Rafuse, 2020）において、筋組織への免疫細胞の浸潤および脱神経を軽減し、無作為化ALS臨床試験の事前に指定されたサブグループにおいて、機能低下の進行を遅らせたことが報告されている（Mora, 2020）。また、末梢マクロファージを調節することで、ALSマウスにおける生存期間を延長することもできた（Chiot, 2020）。 測定可能な筋浸潤を伴うTDP-43モデルは、ほとんどの患者に共通する病態において、こうしたメカニズムを検証する手段を提供する。

筋の炎症は、免疫調節作用を持つALS治療薬の作用機序および標的結合エンドポイントとして、また、NMJの神経支配やCMAPと同じ動物で定量化される場合には、あらゆる治療薬群における疾患重症度の指標として利用することができる。

このエンドポイントが読み取れるメカニズム。

• ケモカイン受容体の遮断、例えばCCL2–CCR2軸の遮断（Nógrádi, 2025）

• C5a–C5aR1における補体阻害（Wang, 2017）

• マスト細胞およびマクロファージに作用するチロシンキナーゼ阻害剤（Trias, 2017;Harrison & Rafuse, 2020）

• 活性化された筋マクロファージに局在するデンドリマー複合体など、マクロファージを標的とした送達（Tallon, 2022）

• 脱神経筋における間質およびサイトカイン経路（例：線維・脂肪分化前駆細胞におけるSTAT3–IL-6シグナル伝達）（Madaro, 2018）

• 末梢マクロファージを枯渇させるのではなく、再プログラムする戦略（Chiot, 2020）

同一動物を用いた統合的なエンドポイント評価パッケージ。

CD45⁺密度、NMJの神経支配クラス、シナプス前部の複雑性、およびCMAPはすべて同一のマウスから得られているため、薬剤による浸潤細胞数の減少がシナプスや筋機能に下流でどのような有益な効果をもたらすかを直接確認することができ、炎症に影響を与えずにNMJを回復させる薬剤と、炎症を介して作用する薬剤とを区別することができる。 これらの測定値は、本モデルですでに検証済みの握力、CTによる筋体積、血漿および脳脊髄液中のニューロフィラメント軽鎖（NfL）、MRIによる脳萎縮、および脳組織病理学的エンドポイントと組み合わせることができ、TDP-43ΔNLSモデルページに記載されているように、サイトカインプロファイリングによって補完することも可能です。

共変量としての炎症負荷。

このコホートにおいて、CD45⁺密度が脱神経およびCMAPにおける個体間の変動の大部分を占めていたため、非免疫療法の研究において、これを共変量または層別化変数として分析することも可能です。これにより、真の治療効果と個体間の疾患重症度の違いを区別するのに役立ちます（Biospective社内分析）。

スポンサーと協議する試験設計上の考慮事項。

• 投与期間および投与経路：誘導期から開始する予防デザインと、脱神経が確立した後に開始する介入デザインがあり、いずれの投与経路も利用可能です。

• 陽性対照：ドキシサイクリンの投与を再開すると、トランスジーンの発現が停止し、再神経化と機能回復が可能となり、疾患修飾のベンチマークとなります（Walker, 2015）。

• 単なる数だけでなく表現型：このモデルではミクログリアが回復を支え、再生促進性マクロファージは疾患進行の遅延と関連しているため（Spiller, 2018;Margotta, 2023）、広範なミエロイド細胞の抑制は逆効果となる可能性がある。したがって、免疫調節プログラムでは分極マーカーの使用が推奨される。

• サンプルサイズ：このモデルに基づく我々の以前のNMJデータセットでは、SV2A–α-BTXのオーバーラップにおける25％の変化を検出するために、群あたり15匹未満のマウスで十分であると推定された。CD45⁺エンドポイントに関する同等の推定値は、本コホートから導き出すことができる（Biospective社内データ）。

スポンサーには、全切片画像データ、個体ごとの定量的指標、NMJクラスマップが提供され、要望に応じて研究切片のインタラクティブなプレゼンテーションも利用可能です。

よくある質問

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