Immunofluorescence multiplexe – Services de marquage tissulaire et d'analyse quantitative d'images

Oui. Pour les colorations fluorescentes, en particulier dans les muscles, le SNC et les tissus humains où l'autofluorescence peut poser problème, nous utilisons systématiquement des solutions d'extinction telles que Sudan Black B, TrueBlack ou TrueView . Ces étapes améliorent considérablement le rapport signal/bruit tout en préservant l'antigénicité et l'intégrité des fluorophores.

Oui. Nous pouvons intégrer des colorants spécifiques à l'amyloïde et aux agrégats dans des panels multiplex lorsque ceux-ci sont compatibles avec les conditions tissulaires et de fixation. La thioflavine S est couramment utilisée pour la détection de l'amyloïde en feuillets β, tandis que le pFTAA offre une sensibilité supérieure et permet de distinguer les différences conformationnelles entre les fibrilles protéiques. D'autres colorants d'agrégation, tels que l'AmyTracker, peuvent également être inclus sur demande.

Notre flux de travail standard prend en charge 4 à 5 marqueurs plus le DAPI en un seul cycle de coloration, en utilisant généralement des fluorophores tels que l'AF488, l'AF555, l'AF647 et l'AF750. Ces colorants sontsélectionnés pour offrir une luminosité élevée, une forte photostabilité et un chevauchement spectral minimal. Nous combinons régulièrement des anticorps primaires provenant de plusieurs espèces hôtes et disposons d'un large portefeuille d'anticorps validés pour une utilisation multiplexe. Lorsque cela est approprié, nous incorporons égalementdes anticorps primaires pré-conjugués afin d'accroître la flexibilité du panel et de réduire la réactivité croisée.

Oui. Nous offrons une assistance complète pour la conception des panels. Ces services comprennent la sélection d'anticorps en fonction de l'espèce hôte, la prévention des réactions croisées, le choix de fluorophores présentant un espacement spectral approprié et la définition de conditions de récupération des antigènes compatibles avec toutes les cibles. Les panels sont validés sur des contrôles positifs et négatifs afin de garantir leur spécificité avant d'être appliqués aux échantillons étudiés.

Oui. Nous proposons des analyses quantitatives allant des mesures d'intensité standard à des analyses d'images très avancées. Notre pipeline comprend l'évaluation de la colocalisation, la segmentation des cellules et des fibres, la quantification régionale et le profilage morphométrique détaillé des jonctions neuromusculaires. Nous analysons également le microenvironnement tissulaire local, y compris les paysages gliaux et inflammatoires, les états d'activation microgliale, les relations de proximité cellulaire et la cartographie spatiale des marqueurs pathologiques dans les structures environnantes. Les résultats peuvent être fournis sous forme de données brutes, de tableaux entièrement traités ou de figures prêtes à être publiées, selon les besoins de votre projet.

Oui, nous le faisons. De nombreux projets nécessitent des anticorps qui ne font pas partie de notre panel standard, et nous validonsfréquemment de nouveaux anticorps primaires, des antigènes rares ou des espèces non standard. Des tests personnalisés peuvent être conçus entièrement en fonction de votre question biologique et de votre type de tissu, y compris des marqueurs à faible abondance, des épitopes conformationnels ou des cibles intracellulaires spécialisées.

Oui. Tous les anticorps sont validés à l'aide de tissus témoinspositifs et négatifs , ainsi que de contrôles par omission. Les anticorps secondaires sont sélectionnés afin d'éviter toute liaison interespèces. Pour les anticorps primaires de souris sur des tissus de souris, nous utilisons des kitssouris-souris appropriés et des stratégies de blocage afin de prévenir tout bruit de fond provenant des IgG endogènes. Une série de dilutions et une optimisation du signal sont effectuées lorsque cela est nécessaire afin d'obtenir une coloration nette et contrastée.

Nous travaillons régulièrement avec des tissus de souris, de rats et d'humains, y compris des échantillons fixés-congelés et FFPE. Notre flux de travail prend en charge un large éventail de types de tissus, notamment les muscles, le SNC, le SNP, les tumeurs et les organoïdes. Pour les échantillons FFPE, nous traitons généralement des coupes de 3 µm, tandis que les échantillons fixés et congelés sont souvent préparés sous forme de coupes plus épaisses, entre 20 et 40 µm. Dans ces tissus plus épais, nous appliquons des incubations prolongées d'anticorps et des protocoles de perméabilisation optimisés afin d'obtenir une coloration profonde et uniforme sur toute la coupe.

Les anticorps primaires de souris sur des tissus de souris nécessitent une manipulation spécialisée .Nous utilisons des kits de fluorescence M.O.M. dédiés, un blocage des récepteurs Fc et des solutions de blocage du sérum ou des IgG (généralement du sérum de chèvre ou d'âne selon l'espèce secondaire). Ces mesures réduisent considérablement le bruit de fond et améliorent grandement le rapport signal/bruit.

Notre imagerie est réalisée à l'aide de systèmes de fluorescence automatisés à grand champ et haute résolution ,optimisés pour le travail multiplex. Ces plateformes permettent l'imagerie de lames entières en mise au point et l'acquisition à plage dynamiqueélevée .

Veuillez contacter notre équipe en fournissant une brève description de vos objectifs, du type de tissu et des résultats attendus. Nous organiserons une consultation, concevrons ou affinerons votre panel, établirons la faisabilité, puis préparerons un devis détaillé et un calendrier de projet.

Bull, J. A., Mulholland, E. J., Leedham, S. J., & Byrne, H. M. Fonctions de corrélation étendues pour l'analyse spatiale des données d'imagerie multiplex. Biol. Imaging ; 4 : e2, 2024 ; doi : 10.1017/S2633903X24000011

Hickey, J. W., Neumann, E. K., Radtke, A. J., Camarillo, J. M., Beuschel, R. T., Albanese, A., McDonough, E., Hatler, J., Wiblin, A. E., Fisher, J., Croteau, J., Small, E. C., Sood, A., Caprioli, R. M., Angelo, R. M., Nolan, G. P., Chung, K., Hewitt, S. M., Germain, R. N., Spraggins, J. M., … Saka, S. K. Cartographie spatiale de la composition protéique et de l'organisation tissulaire : introduction à l'imagerie multiplexée basée sur les anticorps. Nat. Methods, 19 : 284-295, 2022 ; doi : 10.1038/s41592-021-01316-y

Park, J., Kim, J., Lewy, T., Rice, C. M., Elemento, O., Rendeiro, A. F., & Mason, C. E. Technologies omiques spatiales au niveau multimodal et au niveau unicellulaire/subcellulaire. Genome Biol., 23: 256, 2022 ; doi : 10.1186/s13059-022-02824-6

Colorants Alexa Fluor (AF488, AF555, AF647, AF750) : ensemble de fluorophores hautement photostables permettant un multiplexage à quatre couleurs sur une seule lame. Ces colorants offrent un rapport signal/bruit élevé, un chevauchement spectral minimal et permettent une analyse quantitative et spatialement résolue de la colocalisation de plusieurs protéines simultanément.

Récupération des antigènes (HIER, enzymatique, acide formique) : méthodes qui dévoilent les épitopes dans les tissus FFPE afin de permettre la liaison à haute affinité de plusieurs anticorps marqués par fluorescence. Essentiel pour les cibles telles que TDP-43, pTDP-43, Tau, pSyn129, Aβ, MBP, MOG, Olig2, CC1, Iba1 et GFAP. La récupération optimisée des antigènes améliore la préservation des signaux multiplexés et minimise les interférences entre les canaux.

Coloration mIF automatisée : coloration fluorescente standardisée à haut débit, optimisée pour les études précliniques multi-cohortes. Permet la détection simultanée de plusieurs cibles sur une seule coupe tissulaire avec une intensité de signal reproductible, réduisant ainsi la variabilité par rapport à l'IHC séquentielle. Des anticorps primaires provenant de différentes espèces sont utilisés pour permettre une détection distincte, et des anticorps secondaires fluorescents spécifiques à chaque espèce se lient sélectivement à chaque anticorps primaire, permettant ainsi un multiplexage précis.

Analyse de colocalisation : approche quantitative permettant de mesurer le chevauchement spatial des protéines marquées par fluorescence dans une seule coupe tissulaire. Permet de déterminer si des protéines spécifiques sont présentes dans des types de cellules particuliers, d'évaluer la distribution relative des protéines et de cartographier l'adjacence des neurones et des cellules gliales. Se concentre sur la cooccurrence au niveau moléculaire plutôt que sur l'architecture tissulaire au sens large.

Contre-coloration DAPI : colorant nucléaire fluorescent bleu utilisé dans la mIF pour la segmentation nucléaire automatisée, l'identification cellulaire et la quantification morphométrique dans les régions du SNC. Fournit une référence stable pour l'architecture tissulaire et la localisation cellulaire dans l'imagerie par fluorescence multicanal.

mIF sur tissu FFPE : format standardisé et prêt à l'archivage permettant une coloration fluorescente multicolore robuste, une reproductibilité à long terme et une analyse rétrospective des cohortes de maladies neurodégénératives. La mIF permet l'évaluation de plusieurs marqueurs sur la même coupe tissulaire, contrairement à l'IHC chromogénique qui ne cible généralement qu'une seule cible par lame.

Corrélation entre les fluides et les tissus et imagerie, y compris l'IRM : intégration de la mIF avec des biomarqueurs translationnels tels que NF-L, GFAP, Aβ et pTau, combinée à des mesures dérivées de l'IRM (atrophie, T2*, imagerie par tenseur de diffusion, charge lésionnelle). Cette approche multimodale permet une corrélation spatialement résolue entre la pathologie cellulaire et les critères d'évaluation fonctionnels ou structurels de l'imagerie.

Détection par fluorescence : utilisation d'anticorps secondaires conjugués à des fluorophores qui se lient spécifiquement aux anticorps primaires, fournissant des signaux quantitatifs de haute intensité. La fluorescence permet la détection de protéines à faible abondance et l'analyse simultanée de plusieurs marqueurs sur la même coupe, en préservant le contexte spatial et morphologique.

Marqueurs mIF des motoneurones et des jonctions neuromusculaires : marqueurs fluorescents, notamment ChAT, NeuN, βIII-tubuline, SV2 et α-bungarotoxine (BTX) pour les récepteurs postsynaptiques de l'acétylcholine. Permet l'identification des motoneurones, des axones distaux et de la morphologie des jonctions neuromusculaires avec une résolution subcellulaire, ce qui facilite les études de colocalisation de plusieurs marqueurs et la cartographie détaillée de l'intégrité synaptique, impossibles à réaliser avec l'IHC traditionnelle.

Immunofluorescence multiplexe (mIF) : technique permettant la détection simultanée de plusieurs cibles protéiques dans la même coupe tissulaire à l'aide de fluorophores distincts. Préserve les relations spatiales et la morphologie tissulaire, permettant une cartographie détaillée de la coexpression cellulaire, des interactions intercellulaires et de l'organisation du microenvironnement avec une résolution d'une seule lame.

Pathologie de la myéline et des axones mIF : marqueurs tels que MBP, MOG, NF-L, APP, Olig2 et CC1 conjugués à des fluorophores distincts. Facilite la quantification simultanée de la démyélinisation, des états de la lignée oligodendrocytaire et des lésions axonales sur la même coupe tissulaire, tout en préservant les relations spatiales.

Pathologie neurodégénérative mIF Marqueurs : détection fluorescente de TDP-43, pTDP-43, Tau, pTau, Aβ et pSyn129. Permet les études de colocalisation des agrégats protéiques, permettant l'évaluation de la pathologie chevauchante et de la distribution subcellulaire dans les neurones et les cellules gliales.

Marqueurs mIF de neuroinflammation : marqueurs fluorescents, notamment Iba1, GFAP, CD68, CD3 et CD45. Permet l'évaluation sur une seule lame de l'activation microgliale, de l'astrogliose et de l'infiltration immunitaire, révélant les relations spatiales entre les cellules immunitaires et les neurones, ce qui est difficile à réaliser avec l'IHC à cible unique.

Analyse quantitative d'images mIF : extraction automatisée de l'intensité de la fluorescence, de la colocalisation des protéines, de la densité cellulaire, des mesures morphologiques et de la distribution spatiale à l'aide de pipelines de pathologie numérique haut de gamme. La quantification multi-marqueurs permet une comparaison directe des processus pathologiques sur la même section.

Analyse spatiale et morphologique mIF : caractérisation haute résolution de l'architecture tissulaire et de l'organisation du microenvironnement. Permet la visualisation directe de multiples composants cellulaires et de leurs relations spatiales, y compris l'activation gliale et les réponses inflammatoires entourant les caractéristiques pathologiques telles que les plaques amyloïdes. Met en évidence la pathologie régionale, le regroupement cellulaire et les interactions multicellulaires à l'échelle tissulaire, fournissant des informations inaccessibles avec l'IHC conventionnelle.

Lectures mIF del'efficacité thérapeutique : mesure quantitative des changements induits par le traitement dans l'expression de plusieurs marqueurs, la colocalisation, les réponses cellulaires et la préservation de la structure tissulaire. Le multiplexage sur une seule lame permet de détecter des effets thérapeutiques subtils dans les populations neuronales, gliales et synaptiques tout en conservant le contexte spatial et morphologique.

Balayage par fluorescence de la lame entière : imagerie multicanal haute résolution de sections tissulaires entières. Capture la distribution spatiale de plusieurs marqueurs fluorescents tout en préservant l'architecture tissulaire, permettant une analyse quantitative complète et une cartographie détaillée de l'organisation cellulaire et microenvironnementale sur de grandes cohortes.