为什么要在帕金森病的动物模型中测量神经丝轻链？
神经丝轻链（NfL；NF-L）是中间丝蛋白家族中的轻链成员，定位于神经元的轴突细胞质中。当轴突受损或退化时，NfL会释放到细胞外空间，随后可在脑脊液（CSF）和血液（血浆、血清）中测量到。因此，NfL水平可作为轴突损伤和/或神经退化的液体生物标志物。
我们的研究小组在α-突触核蛋白前体纤维（PFF）接种和扩散的帕金森病小鼠模型中，通过体内磁共振成像（MRI）测量了血浆和脑脊液中的NfL水平与全脑体积之间的强相关性。该分析表明，这种液体生物标志物可用于反映大脑萎缩。需要注意的是，生物液体中的NfL水平反映了整个神经系统神经元的总体损伤，而没有神经解剖学的特异性。另一方面，核磁共振成像（MRI）可以测量特定结构（例如，不同的皮质和皮质下区域、脊髓等）的区域变化，包括体积、皮质厚度和脊髓横截面积的变化。因此，血液和脑脊液中的NfL水平以及结构MRI测量应被视为互补方式。
在α-突触核蛋白帕金森病小鼠模型中，通过活体核磁共振成像测量血浆和脑脊液神经丝蛋白水平与全脑体积之间的相关性。
在临床前治疗功效研究中，可以在多个时间点测量NfL水平，从而在同一只动物中进行纵向评估。在研究过程中，可以轻松进行多次采血。在Biospective，我们还可以采集多个活体脑脊液样本，从而对液体NfL水平的时间变化进行综合分析，以监测帕金森病动物模型的疾病进展和治疗干预的效果。
如何测量血液和脑脊液样本中的神经丝轻链？
通常使用酶联免疫吸附测定法（ELISA）或超灵敏单分子阵列（Simoa）测定法对液体样本中的神经丝轻链进行评估。Simoa检测法在原始出版物中详细描述，其灵敏度是酶联免疫吸附法的1000多倍。Simoa是一种先进的单分子蛋白检测技术，采用抗体修饰的顺磁珠，相对于目标分析物的极低浓度，其浓度非常高。这种设置可确保每个微珠最多捕获一个免疫复合物。随后，目标分析物被标记为与检测系统（如链霉亲和素-β-半乳糖苷酶（SβG））或用于多重分析的多种生物素化检测试剂结合的第二个靶向抗体。在引入底物后，检测试剂会产生荧光产物。Simoa灵敏度的关键之处在于单个磁珠产生的荧光强度的浓度，该磁珠被限制在仅容纳一个磁珠的油覆盖微孔中。通过电荷耦合器件（CCD）从单个微孔中捕获的荧光用于获取信号。通过计算阵列中产生信号的微孔比例，可以量化目标蛋白的浓度。
Simoa检测方法灵敏度高、体积要求低，是分析小鼠脑脊液和血液（血浆或血清）样本的理想工具。脑脊液只能收集到非常少量的样本，血液中的NfL浓度也非常低。这种高度灵敏的方法可以检测低至飞克（fg/mL）水平的NfL水平。
小鼠生物液中NfL浓度收集和Simoa分析流程概述。
Simoa的最新进展扩展了其功能，使其能够采用多重检测策略，从而同时评估多种与疾病相关的标记物。多重检测可通过多种技术实现，例如将荧光标记的顺磁微珠与靶向抗体和检测试剂结合使用，生成能够区分多种标记物的复杂荧光信号。例如，神经胶质细胞中的中间丝蛋白——神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）可与神经丝蛋白（NfL）同时测量。GFAP是星形胶质细胞病变的生物标记物，与神经丝蛋白（NfL）互为补充，后者是神经元完整性的生物标记物。这种多重Simoa技术已成功用于评估帕金森病患者血浆中的神经丝蛋白（NFL）、神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、UCHL1和tau水平。
帕金森病的动物模型中，哪些动物的血液和脑脊液中神经丝轻链水平有报道？
我们团队通常会对α-突触核蛋白前体纤维（PFF）接种和扩散小鼠模型的血浆和脑脊液中的神经丝轻链进行测量。为了建立这种模型，我们通过立体定向注射将重组人α-突触核蛋白PFF接种到小鼠大脑的特定区域，以启动α-突触核蛋白聚集物的形成，这些聚集物沿着解剖连接通路传播（所谓的“朊病毒样传播”）。为了产生一种稳定的疾病表型，我们通常将纤维单侧注入前嗅核（AON）以产生边缘系统模型，或注入内侧前脑束（MFB）以产生运动系统模型。我们将纤维注入M83转基因小鼠体内，这些小鼠在鼠朊蛋白启动子（Prnp）的作用下，过度表达人类α-突触核蛋白A53T突变体。我们已证实这种帕金森病小鼠模型存在广泛的神经变性。我们经常观察到这些小鼠的血浆和脑脊液中NfL水平明显升高。
在AON和MFB中注射重组人α-突触核蛋白PFF的M83+/-转基因小鼠的血浆和脑脊液中，NfL（均值和标准差）水平显著升高。
Kasanga等人发现，与假手术组相比，在Sprague-Dawley大鼠中，6-羟基多巴胺（6-OHDA）损伤后血清NfL水平增加了40%。该小组还发现，适度强度有氧运动可显著降低假手术组和6-OHDA组血清NfL水平，其中假手术组降低42%，6-OHDA组降低25%。
Bacioglu及其同事评估了Thy1-hA53T-αS（A53T-αS）小鼠的NfL水平。他们发现，在无症状的2至4个月龄小鼠中，A53T-αS小鼠的脑脊液NfL水平比非转基因对照组高出10倍以上。随后，NfL水平继续升高，在8至10个月大的时候比同年龄的非转基因对照组小鼠高出1000倍。血浆NfL水平在2至4个月大的时候没有显著升高，但在出现症状的阶段则高出100倍。
该小组还评估了接种了来自老年症状性A30P-αS转基因小鼠脑提取物的Thy1-hA30P-αS（A30P-αS）小鼠的NfL水平。对未注射（对照组）A30P-αS小鼠的血浆和脑脊液中的NfL进行测量，结果显示NfL水平随着年龄增长而显著增加，与18-22个月大的A53T-αS小鼠类似。然而，向A30P-αS小鼠注射转基因脑提取物后，这种增加在7-8个月龄时出现。因此，作者认为α-突触核蛋白病理与NfL水平之间存在机制上的联系。
Loeffler等人 评估了61号系α-突触核蛋白转基因模型中的NfL水平。对61号系雄性小鼠3、6、9和12个月大的血浆中的NfL水平进行了分析。他们发现，与非转基因同窝动物相比，NfL水平仅略有增加，且年龄较大的动物差异较大。
克莱门特等人评估了米托帕克（MitoPark）小鼠模型的血浆和脑脊液水平，但并未发现与同窝对照组相比有任何显著升高。
我们的团队非常乐意回答有关帕金森病模型的任何问题，或提供有关我们用于疗效研究的模型的具体信息。
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