パーキンソン病モデルにおけるニューロフィラメント軽鎖
神経フィラメント軽鎖（NfL；NF-L）レベルが、パーキンソン病のマウスおよびラットモデルにおける血液（血漿；血清）およびCSFバイオマーカーとして使用できる方法。
パーキンソン病の動物モデルでニューロフィラメント軽鎖を測定する理由とは？
ニューロフィラメント軽鎖（NfL；NF-L）は、神経細胞の軸索細胞質に局在する中間フィラメントタンパク質のファミリーに属する軽鎖です。軸索が損傷または変性すると、NfLは細胞外空間に放出され、その後、脳脊髄液（CSF）や血液（血漿、血清）中で測定されます。このように、NfLレベルは軸索損傷および／または神経変性の流動性バイオマーカーとして機能します。
私たちのグループは、パーキンソン病のα-シヌクレイン前駆線維（PFF）シード＆スプレッドマウスモデルにおいて、生体内磁気共鳴画像法（MRI）で測定した血漿および脳脊髄液（CSF）のNfLレベルと全脳容積との間に強い相関関係があることを実証しました。この分析は、脳萎縮を反映するこの体液性バイオマーカーの有用性を示しています。生体液中のNfLレベルは、神経解剖学的特異性なしに、神経系全体にわたる神経細胞の損傷の総和を反映していることに注意してください。一方、MRIでは、体積だけでなく皮質厚や脊髄の断面積の変化も含め、特定の構造（例えば、皮質および皮質下の異なる領域、脊髄など）における局所的な変化を測定することができます。そのため、血液およびCSF中のNfLレベルと構造MRI測定は、補完的な方法であると考えられます。
パーキンソン病のα-シヌクレインマウスモデルにおける、生体内MRIで測定した血漿および脳脊髄液中NfLレベルと全脳容積の相関関係。
NfLレベルは、前臨床治療効果研究の間に複数の時点で測定することができ、それにより同一の動物における経時的な評価が可能になります。研究期間中の複数回の採血も容易に行うことができます。バイオスペクティブでは、複数の生体CSFサンプルを採取する能力も備えており、それにより、パーキンソン病の動物モデルにおける病気の進行と治療介入の効果をモニターするために、脳脊髄液（CSF）レベルの経時的プロファイルの包括的な分析を行うことができます。
神経フィラメント軽鎖は、血液およびCSFサンプルでどのように測定されるのですか？
NfLは通常、酵素免疫測定法（ELISA）または超高感度単分子アレイ（Simoa）アッセイのいずれかを用いて、体液サンプルで評価されます。Simoaアッセイは、そのオリジナルの論文で詳細に説明されているように、ELISAの感度を1,000倍以上も上回ります。Simoaは、標的となる分析物の非常に低い濃度に対して、抗体修飾された常磁性ビーズを非常に高い濃度で使用する、高度な単分子タンパク質検出技術です。この設定により、各ビーズが捕捉できる免疫複合体は最大でも1つだけとなります。その後、標的となる分析物は、ストレプトアビジン-β-ガラクトシダーゼ（S&βG）などの検出システムと複合した2番目の標的抗体、または多重分析用の複数のビオチン化検出試薬で標識されます。基質の導入により、検出試薬は蛍光物質を生成します。Simoaの感度の重要な点は、1つの磁気ビーズのみを収容するオイルで覆われたマイクロウェル内で、個々の磁気ビーズから生じる蛍光強度の濃度にあります。 電荷結合素子（CCD）によって個々のウェルから捕捉された蛍光光は、シグナルの取得に使用されます。 アレイからシグナルを生成するウェルの割合を計算することで、標的タンパク質の濃度を定量化することができます。
Simoaアッセイは高感度でサンプル量が少量で済むため、マウスのCSFおよび血液（血漿または血清）サンプルの分析に理想的なツールです。CSFはごく少量しか採取できず、血液中のNfL濃度は非常に低いです。この高感度な手法では、フェムトグラム（fg/mL）レベルの低濃度のNfLも検出できます。
マウスの生体液からNfL濃度の収集とSimoa分析を行うプロセスの概要。
Simoaにおける最近の進歩により、多重化戦略を含む幅広い機能が実現し、さまざまな疾患関連マーカーの同時評価が容易になりました。多重化は、標的抗体および検出試薬と蛍光標識された常磁性ビーズを併用するなど、複数の手法により実現され、複数のマーカーを区別できる複雑な蛍光シグナルを生成します。例えば、アストロサイトに存在する中間フィラメントであるグリア線維性酸性タンパク質（GFAP）は、NfLと同時に測定することができます。 GFAPはアストログリアのバイオマーカーとして機能し、神経細胞の完全性のバイオマーカーであるNfLと相補的な知見を提供します。 この多重Simoa技術は、パーキンソン病患者におけるNFL、GFAP、UCHL1、タウの血漿レベルの評価に成功しています。
パーキンソン病の動物モデルにおいて、神経フィラメント軽鎖の血中および脳脊髄液（CSF）レベルが報告されているものはどれですか？
私たちのグループでは、α-シヌクレイン前駆体線維（PFF）のシード形成および拡散マウスモデルから得た血漿および脳脊髄液中のNfL測定を日常的に実施しています。このモデルの作成には、遺伝子組み換えヒトα-シヌクレインPFFをマウスの脳の特定の領域に定位注入し、解剖学的に接続された経路に沿って伝播するα-シヌクレイン凝集体の形成を開始します（いわゆる「プリオン様伝播」）。頑強な病態を生成するために、通常は線維を片側のみに前嗅球（AON）に注入して辺縁系モデルを生成するか、または内側前脳束（MFB）に注入して運動系モデルを生成します。私たちは、マウスのプリオンタンパク質プロモーター（Prnp）の下でA53T変異を持つヒトα-シヌクレインを過剰発現するM83トランスジェニックマウスに線維を注入します。私たちは、このパーキンソン病マウスモデルにおいて広範囲にわたる神経変性を実証しました。私たちは、これらのマウスから採取した血漿および脳脊髄液の両方において、NfLの著しい上昇を日常的に観察しています。
M83+/- トランスジェニックマウスの血漿および脳脊髄液において、ヒトα-シヌクレインPFFをAONおよびMFBに注入したところ、NfLの著しい上昇（平均±標準偏差）が認められました。
Kasanga 氏らは、Sprague-Dawley ラットに 6-ヒドロキシドーパミン（6-OHDA）を投与したところ、偽手術群と比較して血清 NfL レベルが 40% 増加したことを発見しました。また、このグループは、適度な強度の有酸素運動が、偽手術群と6-OHDA群の両方において血清NfLレベルを有意に低下させることを示しました。偽手術群では42%、6-OHDA群では25%の低下が見られました。
Bacioglu氏らは 、Thy1-hA53T-αS（A53T-αS）マウスのNfLレベルを評価しました。A53T-αSマウスでは、非トランスジェニック対照群と比較して、2～4ヶ月齢の無症状のマウスにおいて、CSF NfLが10倍を超える大幅な増加がすでに観察されました。その後、NfLレベルはさらに上昇し、8～10ヶ月齢では、同年齢の非遺伝子組み換え対照マウスと比較して1,000倍高い値を示しました。血漿NfLレベルは2～4ヶ月齢では有意な上昇は示しませんでしたが、症状が現れた段階では100倍以上の増加を示しました。
このグループは、A30P-αSトランスジェニックマウスから得た脳抽出物を接種したThy1-hA30P-αS（A30P-αS）マウスのNfLレベルも評価しました。非投与（対照）A30P-αSマウスの血漿および脳脊髄液の両方におけるNfLの測定値は、18～22ヶ月齢のA53T-αSマウスと同様に、NfLレベルの顕著な加齢関連増加を示しました。しかし、A30P-αSマウスにトランスジェニック脳抽出物を注入したところ、この増加は7～8ヶ月齢にシフトしました。 したがって、著者らは、α-シヌクレイン病理と流動性NfLレベルの間のメカニズム的関連性を示唆しました。
Loeffler ら（ ）は 、α-シヌクレインのトランスジェニックモデルである Line 61 における NfL レベルを評価しました。雄の Line 61 マウスの血漿を、生後 3、6、9、12 か月で NfL レベルを分析しました。彼らは、高齢の動物では変動が大きいものの、非トランスジェニックの同腹仔と比較して NfL レベルのわずかな上昇しか認めなかったと報告しています。
Clement 氏らは、MitoPark マウスモデルにおける血漿および脳脊髄液のレベルを評価しましたが、同腹仔の対照群と比較して有意な上昇は認められませんでした。
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