为什么要量化星形胶质细胞的形态？
星形胶质细胞是占大脑细胞总数20-40%的胶质细胞，在许多过程中发挥着重要作用，包括突触调节、脂质和离子稳态以及神经递质的清除（Baldwin，2024 ）。它们的主要分支形成星状形态，这也是它们名字的由来。这些主要分支进一步分为更小的分支，然后分成与突触接触的小叶。星形胶质细胞覆盖的区域完全覆盖了中枢神经系统，相邻细胞之间几乎没有重叠。
星形胶质细胞的形态。（A）星形胶质细胞完全覆盖中枢神经系统，形成几乎不重叠的独立三维区域。（B）星形胶质细胞形态示意图。突起从细胞体发出，形成主要分支，再进一步分为小分支，最后形成小叶。星形胶质细胞突起的完整三维范围称为区域。
星形胶质细胞被认为在许多神经系统疾病中扮演着重要角色，包括阿尔茨海默氏症（AD）、肌萎缩性侧索硬化症（ALS）、亨廷顿氏病（HD）和帕金森氏病（PD）（Pekny，2016 ；Booth，2017 ；Yun，2018 ；Lee，2022 ；Lawrence，2023 ）。在许多压力条件下，星形胶质细胞会变得“反应性”（Pekny，2014 ；Escartin，2021 ；Patani，2023 ），具有不同的基因表达谱和剧烈的形态变化，神经解剖学家很早就观察到了这一点（Andriezen，1893 ）。在此背景下，形态学上的“肥大”现象经常出现，主要分支和小分支变得更粗、更短、更分支。
脑缺血导致星形胶质细胞肥大。星形胶质细胞出现在三个区域：未受中风影响的对侧半球、受中风影响但远离损伤的半球以及皮质梗死边缘区。（A）使用GFAP免疫染色观察到反应性星形胶质细胞增生，染色密度更高，强度更接近损伤。比例尺=20μm。(B) 使用共聚焦显微镜对GFAP标记的星形胶质细胞进行3D重建成像，显示分支点增加、突起增厚和体积增大。比例尺=10μm。图片根据知识共享署名许可协议，转载自Wagner等人（Wagner，2013）。
星形胶质细胞形态相关基因在许多神经系统疾病中都有所增加，包括阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症和多发性硬化症（MS）（Endo，2022 ）。在阿尔茨海默病小鼠模型中，在淀粉样β蛋白斑块大量沉积之前就已经检测到了形态变化（Yeh，2011 ；Beauquis，2013 ）。在Biospective，我们假设在临床前研究中量化星形胶质细胞的形态可以作为疾病进展的早期敏感指标。我们使用APP/PS1转基因小鼠模型的研究表明，在测量疾病状态时，量化星形胶质细胞的形态比GFAP染色密度更敏感。
星形胶质细胞的形态量化可以为疾病状态提供敏感的指标。在6、9和12个月龄时，对APP/PS1小鼠后脑皮质的星形胶质细胞增生进行量化，并与6个月龄的对照（野生型）小鼠进行比较。在疾病进展期间，GFAP染色密度（即GFAP阳性像素的比例）逐渐增加（左图）。每只小鼠每个ROI的平均星形细胞激活评分（通过形态学分析得出）也在疾病过程中增加，但变化具有更高的统计意义（右图）。误差线表示平均标准误差（SEM）。P值是通过Dunnett’s T3多重比较测试获得的，其中** p<0.01，*** p<0.001，**** p<0.0001。
我们如何量化组织切片中的星形细胞形态？
实验条件
量化星形细胞形态需要特定的标记。经典方法是进行胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫染色，该蛋白标记星形细胞的中间丝，并能够对初级突起进行成像。然而，GFAP的表达在脑区之间差异很大（Endo，2022 ），并不能完全捕捉星形细胞的形态（Baldwin，2024 ）。为了可视化更精细的结构，如小枝、小叶和细胞区域，需要荧光蛋白（FP）表达或染料注射技术（Bushong，2002 ；Reeves，2011 ）。另一方面，这些方法要么需要稀疏标记，要么需要使用多个荧光团来区分相邻的细胞。目前尚不清楚在何种情况下，对广泛星形细胞形态的高通量定量分析或对稀疏标记细胞的详细表征能够提供更高的灵敏度。
接下来，可以使用切片扫描仪对薄切片进行二维高通量成像，也可以使用共聚焦显微镜对较厚的切片（40-100μm）进行三维成像。需要注意的是，即使使用共聚焦显微镜，轴向分辨率也要比横向分辨率低得多，在解释三维重建时必须格外小心（Baldwin，2024 ）。在研究目标中，必须考虑吞吐量和详细的3D形态评估之间的类似权衡。例如，使用切片扫描仪对星形胶质细胞形态进行自动量化，可用于假定疗法的临床前研究，可扩展到数百万个细胞，并提供疾病状态的敏感指标。
形态学表征的一般步骤
尽管迄今为止发布的工具数量很少，而且通常无法执行所有步骤（Labate，2023 ），但星形胶质细胞形态分析的计算流程与小胶质细胞的计算流程类似。关键步骤包括识别和分离细胞（目标检测）、分割星形胶质细胞以及为分支分析进行骨架处理。然后可以为每个细胞获得多个形态学指标（形态计量学），例如细胞面积、体细胞面积、骨架分支点数量等。如果星形胶质细胞被标记为FP，则可以计算其他指标，例如领土大小和重叠（如果使用多个标记）。然后可以根据形态测量将星形胶质细胞分为特定的形态类型，不过与微胶质细胞形态分析不同的是，这一步通常不会进行。
组间定量分析
形态计量学可以按感兴趣区域（ROI）、动物和组进行汇总，以检测不同组中星形胶质细胞的形态变化。然而，在使用这种方法时，应仔细考虑组内变异性，因为来自同一动物的多个细胞并不代表独立的样本。在比较形态测量分布时，可以使用自举等方法来估计这种组内变异性。相比之下，像微胶质细胞分析中那样对特定形态簇或形态类型的细胞密度进行量化，则可以避免这一难题。
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AD小鼠模型的形态变化
在多种AD小鼠模型中观察到了星形胶质细胞形态的变化。例如，在脑淀粉样血管病（CAA）小鼠模型（Tg-FDD，家族性丹麦痴呆症）中，在GFAP染色的小胶质细胞中观察到分支增加以及反应性标记物（C3）的表达增加（Taylor，2020 ）。在该模型中，观察到明显的星形胶质细胞增生，而没有小胶质细胞增生。
Endo等人（Endo，2022 ）使用AD的APP/PS1小鼠模型观察了皮质星形胶质细胞的形态变化。在这项研究中，除了其他形态测量外，还使用FP标记星形胶质细胞，以量化其领土大小。在健康的大脑中，作者将不同区域基因表达的变化（通过大量和单细胞转录组学获得）与形态测量学的变化相关联，以识别推定的形态基因模块。通过基因敲除验证了这些模块中的两个基因，即Ezrin和Fermt2，结果发现星形胶质细胞区域变小，且受影响小鼠在认知任务中的表现也发生了变化。在小鼠模型和人类AD组织中，发现显著下调的基因与区域大小呈正相关。通过显微镜观察小鼠模型，发现皮质星形胶质细胞区域变小。最后，发现与星形胶质细胞区域大小相关的基因在多种神经系统疾病中（包括AD、MS和ALS）都大量存在。
Yeh等人（Yeh，2011 ）量化了AD（3xTg-AD）慢进展小鼠模型中星形胶质细胞的形态。在嗅皮层中，早在一个月龄时，星形胶质细胞表面和体积就已出现显著萎缩，远早于斑块和细胞外聚集物的检测（12个月）。
治疗影响星形胶质细胞形态
在另一种AD小鼠模型（PDAPP-J20转基因小鼠）中，Beauquis等人（Beauquis，2013 ）研究了环境丰富化（EE）对海马淀粉样蛋白和β负荷以及星形胶质细胞形态的治疗效果。与未经治疗的转基因小鼠相比，环境丰富化小鼠的淀粉样蛋白斑块负荷明显降低。作者分别分析了斑块相关星形胶质细胞（PAA，在该研究中定义为斑块小于50微米）和非斑块相关星形胶质细胞的形态。他们发现，在未经治疗的转基因小鼠中，远离斑块的星形胶质细胞明显萎缩，而PAA的体积却增加了。环境丰富化（EE）减少了PAA和远离斑块的星形胶质细胞的形态变化。在斑块大量堆积之前，还观察到星形胶质细胞分支的增加。
Chandra等人（Chandra，2023 ）使用AD的APP/PS1小鼠模型，研究了抗生素治疗对雄性小鼠肠道微生物群改变的影响。他们发现，与未治疗的动物相比，治疗减少了星形胶质细胞和PAA的数量。GFAP染色的PAA的形态也受到治疗的影响，体细胞面积减少，平均突起长度增加（即表明肥大程度降低）。功能标记也发生了变化，与空白对照组相比，治疗组C3减少，Ezrin增加。Ezrin的表达与多种形态测量指标密切相关。使用粪便移植重新引入微生物群可消除这些影响，而无菌小鼠则表现出与抗生素治疗小鼠相似的变化。作者通过使用CSF1R抑制剂耗竭小胶质细胞，表明抗生素治疗对PAA形态的影响取决于小胶质细胞的存在，但星形胶质细胞数量的减少是独立发生的。
Canepa等人（Canepa，2023 ）测试了两种碳酸酐酶抑制剂——甲唑酰胺和乙酰唑胺，作为TgSwDI AD小鼠模型的假定疗法。他们发现，治疗可以减少淀粉样蛋白斑块负荷，并减轻星形胶质细胞的肥大。与空白对照组相比，治疗组中微胶质细胞形态也受到的影响较小。
星形胶质细胞的新形态
Sokolova等人（Sokolova，2024） 在AD小鼠模型和人类AD组织中发现了星形胶质细胞的新形态。他们使用FP表达来可视化星形胶质细胞形态，并发现了在斑块大量堆积之前具有“球状”突起和较高p62表达水平的星形胶质细胞。这种形态主要位于海马体，无法通过GFAP染色观察到，但使用S100β也可以观察到。与邻近的星形胶质细胞相比，这些星形胶质细胞的领土面积较小，与淀粉样蛋白斑块没有空间上的关联。作者发现，这些“球状”星形胶质细胞在淀粉样蛋白病早期通过分泌MFG-E8（糖蛋白乳脂球-EGF因子8）促进小胶质细胞的突触吞噬，这一新发现为治疗干预开辟了潜在途径。
一种新的星形胶质细胞形态被命名为“球状”。（A）显微镜图像比较了典型的、浓密的星形胶质细胞形态与NL-F敲入AD小鼠模型中的“球状”形态。星形胶质细胞使用FP（tdTomato）标记，显示了它们的完整形态。在“球状”星形胶质细胞的突起中可以观察到球状突起。（B）这些突起无法通过GFAP免疫染色观察到，但可以通过S100β观察到。比例尺=15μm。图片摘自Sokolova等人（Sokolova，2024） 的《知识共享署名许可协议》。
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