왜 성상교세포의 형태를 정량화해야 할까요?
성상교세포는 뇌의 세포 중 약 20-40%를 차지하는 신경교세포로, 시냅스 조절, 지질 및 이온 항상성, 신경전달물질 제거 등 많은 과정에서 중요한 역할을 합니다 (Baldwin, 2024 ). 그들의 과정의 주요 가지들은 별 모양의 형태를 만들어 냅니다. 이것이 바로 그들의 이름의 유래입니다. 이 주요 가지들은 더 작은 가지들로 나뉘고, 그 다음에는 시냅스와 접촉하는 잎사귀로 나뉩니다. 성상교세포가 덮고 있는 영역은 인접한 세포들 사이에 거의 겹치는 부분이 없이 중추신경계를 완전히 덮고 있습니다.
성상교세포의 형태. (A) 성상교세포는 중추신경계를 완전히 덮고 있으며, 거의 겹치지 않는 뚜렷한 3차원 영역으로 나뉩니다. (B) 성상교세포의 형태를 나타내는 도식. 성상교세포의 돌기는 체세포에서 주요 가지로 뻗어나가며, 이 가지들은 다시 작은 가지와 작은 잎으로 나뉩니다. 성상교세포 돌기의 전체 3D 범위는 영역이라고 합니다.
성상교세포는 알츠하이머병(AD), 근위축성 측삭 경화증(ALS), 헌팅턴병(HD), 파킨슨병(PD)을 포함한 많은 신경학적 장애에서 중요한 역할을 하는 것으로 여겨집니다 (Pekny, 2016 ; Booth, 2017 ; Yun, 2018 ; Lee, 2022 ; Lawrence, 2023 ). 많은 스트레스 조건 하 에서 , 성상교세포는 신경해부학자들이 일찍이 관찰한 다양한 유전자 발현 프로파일과 급격한 형태학적 변화와 함께 '반응성'이 될 수 있습니다(Pekny, 2014 ; Escartin, 2021 ; Patani, 2023 ). 이 맥락에서 형태학의 '비대' 현상이 자주 관찰되는데, 주요 가지와 가지가 더 두꺼워지고 짧아지며 더 많이 갈라지는 현상입니다.
뇌 허혈로 인한 성상교세포 비대. 성상교세포는 뇌졸중으로 영향을 받지 않은 반대쪽 반구, 영향을 받은 반구이지만 손상 부위로부터 멀리 떨어진 곳, 그리고 피질 경색 경계 영역의 3개 영역에 나타납니다. (A) GFAP 면역염색을 사용하여 반응성 성상교세포증을 관찰한 결과, 손상 부위에 가까울수록 염색 밀도와 강도가 더 높게 나타났습니다. 배율 = 20μm. (B) 공초점 현미경을 사용하여 촬영한 GFAP 표지된 성상교세포의 3D 재구성 사진으로, 가지의 증가, 돌기의 두꺼워짐, 부피의 증가를 보여줍니다. 배율 = 10μm. Wagner et al.(Wagner, 2013) 의 그림을 크리에이티브 커먼즈 저작자표시 라이선스에 따라 재현했습니다.
아스트로사이토의 형태와 관련된 유전자가 알츠하이머병, 루게릭병, 다발성 경화증(MS)을 포함한 많은 신경계 질환에서 풍부하게 발견되었습니다 (Endo, 2022 ). 알츠하이머병 마우스 모델에서, 상당한 아밀로이드 베타 플라크 침착이 일어나기 전에 형태학적 변화가 감지되었습니다 (Yeh, 2011 ; Beauquis, 2013 ). 바이오스펙트럼에서는 전임상 연구에서 성상교세포의 형태를 정량화하는 것이 질병 진행의 초기 및 민감한 지표가 될 수 있다는 가설을 세웠습니다. APP/PS1 형질전환 마우스 모델을 사용한 연구에서 성상교세포의 형태를 정량화하는 것이 GFAP 염색 밀도보다 질병 상태를 측정하는 데 더 민감하다는 사실이 밝혀졌습니다.
성상교세포의 형태를 정량화하면 질병 상태를 민감하게 측정할 수 있습니다. APP/PS1 마우스의 후두엽에서 6, 9, 12개월령에 성상교세포증을 정량화하고, 6개월령의 대조군(야생형) 마우스와 비교합니다. GFAP 얼룩 밀도(즉, GFAP 양성 픽셀의 비율)는 질병 진행 과정에서 점진적으로 증가합니다(왼쪽). 형태학 분석에서 얻은 마우스당 ROI당 평균 성상교세포 활성화 점수도 질병 진행 과정에서 증가하지만, 그 변화는 통계적으로 더 유의미합니다(오른쪽). 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타냅니다(SEM). ** p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001로 Dunnett의 T3 다중 비교 테스트를 사용하여 P-값을 얻었습니다.
조직 단면에서 성상교세포의 형태를 어떻게 정량화할 수 있을까요?
실험 조건
성상교세포의 형태를 정량화하려면 특정 표지가 필요합니다. 전통적인 방법은 성상교세포의 중간 필라멘트를 표시하고 주요 과정을 이미지화할 수 있는 성상교세포 섬유아산단백질(GFAP)에 대한 면역염색을 수행하는 것입니다. 그러나 GFAP 발현은 뇌 영역에 따라 크게 다르며 (Endo, 2022 ), 성상교세포의 형태를 완전히 포착하지 못합니다 (Baldwin, 2024 ). 가지, 잎, 세포 영역과 같은 미세한 구조를 시각화하기 위해서는 형광 단백질(FP) 발현 또는 염료 주입 기술이 필요합니다 (Bushong, 2002 ; Reeves, 2011 ). 반면에, 이러한 방법은 희박한 라벨링 또는 인접한 세포를 분리하기 위한 다중 형광체의 사용을 필요로 합니다. 광범위한 성상교세포 형태학의 고처리량 정량화 또는 희박하게 라벨링된 세포의 상세한 특성화가 어느 상황에서 더 큰 민감도를 제공하는지는 아직 결정되지 않았습니다.
그런 다음, 슬라이드 스캐너를 사용하여 얇은 조각에서 높은 처리량으로 2D로, 또는 더 두꺼운 부분(40-100μm)에서 공초점 현미경을 사용하여 3D로 성상교세포를 이미지화할 수 있습니다. 공초점 현미경의 경우에도 축 방향 해상도가 측면 해상도보다 훨씬 낮기 때문에 3D 재구성을 해석할 때 주의해야 한다는 점에 유의해야 합니다 (Baldwin, 2024 ). 처리량과 상세한 3D 형태학적 평가 사이의 유사한 절충은 연구의 목적에 따라 고려되어야 합니다. 예를 들어, 슬라이드 스캐너를 사용하여 촬영한 성상교세포의 형태를 자동 정량화하는 것은 추정 치료제의 전임상 연구에 사용될 수 있으며, 수백만 개의 세포로 확장하여 질병 상태에 대한 민감한 지표를 제공할 수 있습니다.
형태적 특성화를 위한 일반적인 단계
성상교세포 형태 분석의 전산 파이프라인은 미세아교세포의 전산 파이프라인과 유사하지만, 지금까지 발표된 몇 가지 도구들은 일반적으로 이러한 모든 단계를 수행하지는 않습니다 (Labate, 2023 ). 주요 단계로는 세포 식별 및 분리(객체 탐지), 성상세포 분할, 분지 분석용 골격화 과정 등이 있습니다. 그런 다음, 세포 면적, 체세포 면적, 골격의 분기점 수 등과 같은 여러 가지 형태학적 지표(형태계측)를 각 세포에 대해 얻을 수 있습니다. 성상세포에 FP가 표시되어 있다면, 영역 크기 및 중복(여러 개의 마커를 사용하는 경우)과 같은 추가 지표를 계산할 수 있습니다. 그 다음에, 성상교세포의 형태를 형태계측에 기초하여 특정한 형태형으로 분류할 수 있습니다. 그러나, 미세아교세포 형태 분석과는 달리, 이 단계는 일반적으로 수행되지 않았습니다.
그룹 간 양적 분석
형태 측정법은 관심 영역(ROI), 동물, 그룹별로 집계할 수 있으며, 이를 통해 그룹 간 성상교세포의 형태 변화를 감지할 수 있습니다. 그러나 이 접근법을 사용할 때는 그룹 내 변동을 주의 깊게 고려해야 합니다. 동일한 동물의 여러 세포가 독립적인 표본을 나타내지 않기 때문입니다. 부트스트래핑과 같은 기법을 사용하면 형태 측정 분포를 비교하면서 이러한 그룹 내 변동을 추정할 수 있습니다. 반면에, 미세아교세포 분석에서 수행되는 것과 같이 특정 형태학적 군집 또는 형태형에 속하는 세포의 밀도를 정량화하면 이러한 문제를 피할 수 있습니다.
알츠하이머병 치료제 개발에 성상교세포 형태 정량화를 어떻게 활용할 수 있을까요?
AD 마우스 모델의 형태학적 변화
AD의 여러 마우스 모델에서 성상교세포의 형태학적 변화가 관찰되었습니다. 예를 들어, 뇌 아밀로이드 혈관병증(CAA) 마우스 모델(Tg-FDD, 가족성 덴마크 치매)에서 GFAP 염색된 성상교세포에서 분지 증가와 반응성 표지자(C3)의 발현 증가가 관찰되었습니다 (Taylor, 2020 ). 이 모델에서 미세아교증 없이 상당한 성상교세포증이 관찰되었습니다.
Endo et al. (Endo, 2022)은 AD의 APP/PS1 마우스 모델을 사용하여 대뇌 피질의 성상교세포의 형태학적 변화를 관찰했습니다. 이 연구에서 성상교세포는 FP를 사용하여 다른 형태 측정과 함께 영역 크기를 정량화했습니다. 건강한 뇌에서 저자들은 대량 및 단일 세포 전사체학으로 얻은 영역 간 유전자 발현의 변화와 형태 측정 변화를 연관시켜 추정 형태학 유전자 모듈을 식별했습니다. 이 모듈의 두 유전자인 Ezrin과 Fermt2는 유전자 결핍에 의해 검증되었으며, 그 결과 성상세포의 영역 크기가 작아지고 영향을 받은 생쥐의 인지 과제에 변화가 나타났습니다. 생쥐 모델과 인간 알츠하이머병 조직 모두에서 유의미하게 하향 조절된 것으로 밝혀진 유전자는 영역 크기와 양의 상관관계가 있었습니다. 생쥐 모델에서 현미경으로 관찰한 결과, 대뇌 피질의 성상세포의 영역 크기가 작아지는 것이 관찰되었습니다. 마지막으로, 확인된 성상세포 영역 크기 관련 유전자는 알츠하이머병, 다발성 경화증, 루게릭병을 포함한 여러 신경학적 장애에서 풍부하게 발견되었습니다.
Yeh et al. (Yeh, 2011 )은 AD(3xTg-AD)의 진행이 느린 마우스 모델에서 성상교세포의 형태를 정량화했습니다. GFAP에 대한 면역염색을 통해 측두엽 피질에서 1개월령의 성상교세포 표면과 부피의 현저한 위축이 관찰되었으며, 이는 플라크와 세포외 응집체의 검출(12개월)보다 훨씬 이른 시기였습니다.
치료가 아스트로사이트의 형태에 미치는영향
또 다른 AD 마우스 모델(PDAPP-J20 형질전환 마우스)에서 Beauquis et al. (Beauquis, 2013 )은 환경 강화(EE)가 아밀로이드-β 부하와 해마의 아스트로사이트형태에 미치는 치료 효과를 연구했습니다. EE를 받은 마우스는 치료를 받지 않은 형질전환 마우스에 비해 아밀로이드 플라크 부하가 현저히 낮았습니다. 저자들은 플라크와 관련된 성상교세포(PAA, 해당 연구에서 플라크가 50μm 미만인 것으로 정의됨)와 플라크와 관련이 없는 성상교세포의 형태를 개별적으로 분석했습니다. 그들은 치료되지 않은 형질전환 생쥐에서 플라크에서 멀리 떨어진 성상교세포는 현저한 위축이 있는 반면, PAA는 부피가 증가했다는 것을 발견했습니다. EE는 PAA와 플라크에서 멀리 떨어진 성상교세포 모두에 대한 형태학적 변화를 감소시켰습니다. 성상교세포의 분지 증가도 상당한 플라크 축적 전에 관찰되었습니다.
AD의 APP/PS1 마우스 모델을 사용하여 Chandra et al. (Chandra, 2023) 은 수컷 생쥐의 항생제 치료로 인한 장내 미생물 군집 변화의 영향을 연구했습니다. 그들은 치료하지 않은 동물에 비해 치료한 동물의 성상교세포와 PAA의 수가 감소했다는 것을 발견했습니다. GFAP 염색된 PAA의 형태도 치료의 영향을 받아, 체세포 영역의 비율이 감소하고 평균 프로세스 길이가 증가했습니다(즉, 비대 감소). 기능적 표지자도 변경되었으며, 치료는 대조군과 비교하여 C3를 감소시키고 Ezrin을 증가시켰습니다. Ezrin 발현은 여러 형태 측정과 잘 상관되었습니다. 배설물 이식을 통해 미생물 군집을 다시 도입하면 이러한 효과가 무효화되는 반면, 무균 생쥐는 항생제 처리된 생쥐와 유사한 변화를 보였습니다. 저자들은 CSF1R 억제제를 사용하여 미세아교세포를 고갈시킴으로써 항생제 치료가 PAA 형태에 미치는 영향은 미세아교세포의 존재 여부에 따라 달라지는 반면, 성상교세포의 수 감소는 독립적으로 발생한다는 것을 보여주었습니다.
Canepa 외(Canepa, 2023 )는 TgSwDI 마우스 모델의 알츠하이머병 치료제로서 메타졸아미드와 아세타졸아미드라는 두 가지 탄산탈수효소 억제제를 시험했습니다. 그들은 이 치료법이 아밀로이드 플라크의 양을 줄이고 성상교세포의 비대를 감소시킨다는 사실을 발견했습니다. 또한, 미세아교세포의 형태도 대조군에 비해 치료군에서 덜 영향을 받았습니다.
새로운 형태의 성상교세포(
) Sokolova et al. (Sokolova, 2024) 은 알츠하이머병 마우스 모델과 인간 알츠하이머병 조직에서 새로운 유형의 성상교세포형태를확인했습니다. FP 발현을 사용하여 성상교세포 형태를 시각화함으로써, 그들은 강력한 플라크 축적 이전에 "구근형" 과정과 높은 수준의 p62 발현을 보이는 성상교세포를 확인했습니다. 주로 해마에 위치한 이 형태는 GFAP 염색으로는 시각화할 수 없었지만, S100β를 사용해서도 관찰되었습니다. 이 성상교세포는 또한 인접한 성상교세포에 비해 영역 크기가 더 작았고, 아밀로이드 플라크와 공간적으로 상관관계가 없었습니다. 연구자들은 이러한 "구근형" 성상교세포가 아밀로이드증의 초기 단계에서 MFG-E8(밀크피트글로불린-EGF 인자 8)의 분비를 통해 미세아교세포의 시냅스 포획을 촉진한다는 사실을 발견했는데, 이는 치료적 개입의 가능성을 열어주는 새로운 발견입니다.
새로운 아스트로사이트 형태인 "bulbous"의 확인. (A) AD의 NL-F knock-in 마우스 모델에서 전형적인, 덤불 모양의 아스트로사이트 형태와 "bulbous" 형태를 비교한 현미경 이미지. 아스트로사이트는 FP(tdTomato)를 사용하여 라벨링되어 완전한 형태를 보여줍니다. 구형 돌출부는 "구형" 성상교세포의 과정에서 관찰할 수 있습니다. (B) 이 돌출부는 GFAP 면역염색을 사용하면 관찰할 수 없지만, S100β를 사용하면 관찰할 수 있습니다. 배율 = 15μm. Sokolova 외(Sokolova, 2024 ) 의 그림을 크리에이티브 커먼즈 저작자표시 라이선스에 따라 재생산.
저희 팀은 Astrocyte Morphology에 관한 질문이나 치료 효능 연구에 사용하는 AD 모델에 관한 구체적인 정보를 제공해 드릴 수 있습니다.
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