큐프리존 모델에서의 탈수초화 & 재수초화
다발성 경화증(MS)의 큐프리존 탈수초 마우스 모델에서 미엘린 및 올리고덴드로사이트를 측정하는 데 사용할 수 있는 방법의 개요.
컵리즈론에 의한 다발성 경화증의 탈수초화 모델은 무엇입니까?
다발성 경화증(MS)은 중추신경계(CNS)에 영향을 미치는 만성 자가면역성 탈수초성 질환으로, 전 세계적으로 280만 명 이상이 이 질환을 앓고 있습니다(Walton, 2020).MS 연구에서는 리소레시틴(LPC) 마우스 및 랫트 모델과 큐프리존 마우스 모델(Dedoni, 2023 )과 같은 탈수초화 모델을 포함하여 질병의 다양한 측면을재현하기 위해 다양한 전임상 모델이 사용됩니다 .
컵리즈온을 투여한 생쥐의 뇌량에서 탈수초화의 예시. 왼쪽은 정상적으로 수초화된 뇌량이고, 오른쪽은 부분적으로 탈수초화된 백질입니다.
컵리즈 론 모델은 널리 사용되는 독소 유발 다발성 경화증 모델입니다 (Kipp, 2024; Zhan, 2020). Cup rizone(C14H22N4O2) 또는 옥살산 비 스[사이클로헥실리덴 하이드라지드] 는 구리 킬레이트제로서, 경구 투여 시 성숙한 올리고덴드로사이트의 사멸을 유도 하고 설치류 뇌의 특정 백질 영역의 탈수초화를 유발합니다 (Dedoni, 2023). 이모델은 뇌 내의 선천성 면역 세포의 활성화를 포함하지만, T와 B 림프구는 중심적인 역할을 하지 않습니다 (Wolf, 2018). 따라서 이 모델은 적응성 면역 체계가 관여하는 다른 MS 모델 (예: 실험적 자가면역뇌척수염(EAE),Theiler의 쥐 뇌증 바이러스(TMEV), 기타바이러스성 MS 모델 (Dedoni, 2023 ))과 구별됩니다 . 컵리즈론에 의한 탈수초화는 림프구 의존적이지 않으며, 림프구가 결핍된 재조합 활성화 유전자(Rag) 결손 마우스에서도 발생합니다 (Hiremath, 2008).
컵리존의 분자 구조; C14H22N4O2; 분자량: 278.45 g/mol
컵리즈론 모델은 연구자들이 다발성 경화증의 진행에 있어서 특정 메커니즘을 분석하고 조사할 수 있도록 해줍니다.이 설치류 모델은 두 단계로 나눌 수 있습니다. ( 1) 뇌량과 소뇌 상부 가지를 비롯한 다른 뇌 영역에서 초기 탈수초화 (Vega-Riquer, 2019), 선천성 면역체계의 활성화가 동반됨, (2) 큐프리즈온 치료가 종료된 후 노출된 축삭의 상당한 재수초화 (Gharagozloo, 2022).
실제로 생쥐에게 5-6주 동안 큐프리존을 투여합니다. 이 접근법은 선택적 수초세포 스트레스와 사멸을 유발하여 뚜렷한 뇌 하위 영역의 급성 탈수초화, 광범위한 미세아교세포 활성화 및 성상교세포 증식, 축삭 수송 메커니즘의 붕괴 (Rühling, 2019), 그리고 더 만성적인 모델에서는 명백한 축삭 손상을 초래합니다 (Lindner, 2009). 올리고덴드로사이트 변성의 정확한 메커니즘은 완전히 밝혀지지 않았지만, 큐프리존으로 인한 구리 결핍으로 인한 미토콘드리아 파괴, 페로토시스 (Jhelum, 2020), 소포체 스트레스 반응 등이 포함될 수 있습니다.
컵리즈온의 효과에 대한 타임라인은 잘 기록되어 있습니다. 초기 단계, 즉 치료 첫 주 이내에 치료 시작 후 이틀 만에 소교세포의 죽음을 관찰할 수 있습니다. 아교세포 (Kipp, 2023)와 미세아교세포 (Gudi, 2014)가 조기에 활성화된 후 성숙한 올리고덴드로사이트가 급속히 소실되는데, 둘째 날에는 약 65%, 첫 주 말에는 80%가 소실됩니다 (Kipp, 2023). 중간 단계(1~3주)에서는 미엘린 세포의 소실과 신경교 세포의 활성화가 계속되며, 탈수초화 및 급성 축삭 병리학의 징후가 분명해집니다 (Crawford, 2009; Kipp, 2023).
컵리즈론 모델의 신경염증 시간 경과에 대한 개요. 컵리즈론 노출 기간 동안, 신경염증 상태에 기여하는 활성화된 미세아교세포와 반응성 성상교세포(분홍색)의 개체수가 급격히 증가하는 것과 동시에 미엘린(보라색)의 손실이 발생합니다. 성상교세포와 미세아교세포는 모두 미엘린 잔해물의 제거와 올리고교세포 전구세포의 활성화에 적극적인 역할을 합니다. 컵리존의 자극이 제거 되고 축삭의 재수초화가 이루어지면 신경염증은 해결됩니다.
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3~5주 사이에 탈수초화가 눈에 띄게 나타나고, OPC가 활성화되어 손실된 올리고덴드로사이트를 대체합니다 (Brousse, 2015). 주로 공간 기억과 사회적 행동에서 운동 조정 장애와 행동 결함이 분명해집니다 (Franco-Pons, 2007). 이 단계에서 컵리즈온이 함유된 식단을 표준 식단으로 바꾸면 탈수초화 과정이 중단되고 재수초화가 일어납니다.
큐프리즈온 모델의 탈수초와 재수초의 타임라인에 대한 개요입니다. 큐프리즈온 노출 기간 동안, 미엘린(보라색)의 손실, 성숙한 올리고덴드로사이트(파란색)의 죽음, 그리고 올리고덴드로사이트 전구세포(녹색)의 증식과 분화가 현저하게 증가하여 미엘린화 전 올리고덴드로사이트 전구세포(OPCs)가 됩니다. OPC는 큐프리즈온이 존재하는 동안에도 조직 손상 부위에서 이동하고 분화합니다. 큐프리즈온의 자극이 제거되면, OPC는 빠르게 성숙한 올리고덴드로사이트로 분화하여 노출된 축삭의 재수초화를 시작합니다.
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치료가 12주 이상 지속되면 탈수초가 만성화되어 OPC 집단이 소진되고 재수초화 가능성이 크게 감소할 수 있습니다(Lindner, 2009). 수많은 연구에서 큐프리즈온에 장기간 노출되면 제한된 내인성 재수초화 능력 (Leo, 2022), 장기간의 성상교세포증 (Hibbits, 2012), 더 광범위한 축삭 손상 (Lindner, 2009)을 보이는 만성 병변이 유발된다는 사실이 밝혀졌습니다. 요약하자면, 큐프리즈온 모델은 MS 연구에서 중요한 도구입니다. 이 모델은 질병의 주요 측면, 특히 올리고덴드로사이트 변성과 그에 따른 탈수초화를 재현하기 때문입니다. 큐프리즈온에 의한 손상의 타임라인과 메커니즘을 이해하는 것은 MS에 대한 표적 치료 개입을 개발하는 데 필수적입니다.
컵리즈온 마우스의 탈수초화 및 재수초화를 평가하는 가장 일반적인 방법은 무엇입니까?
탈수초와 재수초 과정을 효과적으로 연구하고 이해하기 위해서는 중추신경계(CNS) 내에서 미엘린과 탈수초 및 재수초 과정을 감지하는 신뢰할 수 있는 기술을 사용하는 것이 중요합니다. 조직학적 및 면역조직화학적(IHC) 기술을 통해 실험 조직에서 미엘린을 시각화할 수 있습니다. 미엘린 수초의 초 구조 적 분석은 전자 현미경(EM)으로 시각화할 수 있으며, 고해상도 이미지를 제공합니다 . 자기공명영상(MRI)과 같은 첨단 비침습적 생체 내 영상 기법은 진행 중인 과정에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 이러한 각 기법은 미엘린 관련 장애에 대한 심층적인 이해를 촉진할 수 있지만, 아래에 설명된 바와 같이 각각 장단점이 있습니다.
조직 염색
컵리즈온 마우스의 탈수초와 재수초를 평가하는 데 사용할 수 있는 조직화학 기법에는 다양한 종류가 있습니다. 아래에 몇 가지 일반적으로 사용되는 염색 방법이 강조 표시되어 있습니다.
럭솔 패스트 블루(LFB)
Luxol Fast Blue (LFB)는 조직 단면에서의 수초화에 대한 통찰을 제공하는 데 사용되는 신속한 조직학적 염색제입니다. 이 염색제는 축삭이 탈수초화된 명확한 공극을 효과적으로 드러내며, 수초 손상의 정도를 확인하는 데 유용합니다. LFB 방법은 조직을 과다 염색한 다음, 탄산리튬으로 분화시켜 수초화 영역과 탈수초화 영역을 구분하는 것입니다. 최적의 염색을 위해서는 특정 조직에 맞게 분화 단계를 조정해야 합니다. 그러나 이 과정은 배치별로 상당한 차이를 유발할 수 있기 때문에 LFB는 정량 분석에 적합하지 않습니다.
FluoroMyelin® 및 기타 미엘린 결합 형광 염색약
FluoroMyelin® 염색은 상업적으로 이용 가능한 형광 염료로, 미엘린에 대한 선택적 친화성을 가지고 있습니다. 이 염료는 뇌 조직 섹션 내의 다른 표지자와 함께 미엘린을 시각화하기 위해 사용할 수 있는 다양한 형광 색상으로 개발되었습니다. 수많은 다른 형광 화합물들도 개발되어 왔습니다. 이러한 형광성 미엘린 결합 화합물의 단점은 강한 배경 염색을 생성하는 경향이 있고, 염색 대비가 낮고, 밝기가 낮은 경우가 많아서 정량적 다중 염색에 사용하기 어렵다는 점입니다.
은색 얼룩
은염색은 조직 구조를 시각화하는 데 사용되는 매우 민감한 기술이지만, 맞춤 개발 시간이 필요한 힘든 절차이기 때문에 배치별 변동성이 큽니다. 은염색은 매우 민감하지만, 동적 범위가 매우 낮고 다양한 다른 단백질 구조를 염색하는 경향이 있어 정량 분석에 적합하지 않습니다.
톨루이딘 블루
톨루이딘 블루 O는 미엘린(다른 구조물들 중에서도)에 결합하는 음이온성 조직학적 염료로, 미엘린 랩핑을 상세하게 시각화할 수 있게 해줍니다. 이 물질은 말초 신경에 자주 사용되지만, 도전적인 작업이지만, 중추신경계에서도 사용할 수 있습니다. 조직 준비 과정은 EPON 수지 매립이 필요하기 때문에 힘들지만, 반박막(0.5-1μm) 플라스틱 매립 조직 섹션을 염색할 때 가장 효과적입니다. 뇌량 내 수초의 시각화는 작은 조직 샘플에서 최적의 결과를 얻을 수 있고, 수초를 효과적으로 시각화하기 위해서는 절편이 축색돌기에 수직이어야 하기 때문에, 상세한 해부가 필요합니다. 이 방법의 단점은 시간이 많이 걸리고, 동일한 조직에 대한 면역염색을 할 수 없다는 것입니다. 또한, 톨루이딘 블루 O 염색은 다른 구조물에 결합하기 때문에, 조직 샘플링을 신중하게 해야 합니다.
면역조직화학(IHC)
조직 섹션에 MBP(Myelin Basic Protein), PLP(Proteolipid Protein), MOG(Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein)와 같은 마커를 이용한미엘린 면역조직화학 염색 은 성숙한 미엘린 수초 세포 과정과 세포체와 관련된 미엘린 외피를 식별하는 데 매우 효과적입니다. 이 기법은 미엘린 수준을 정량화하고 미엘린 손상의 정도를 시각화하는 데는 탁월하지만, 미엘린을 생성하는 세포의 수를 열거하는 데는 적합하지 않습니다.
Olig2, PDGF-α-Receptor (PDGFRα), NKX2.2와 같은 oligodendrocyte 계통 표지자에 대한 면역조직화학 염색은 oligodendrocyte 전구세포(OPC)의 성숙과 분화 단계에 대한 중요한 통찰을 제공합니다. 이러한 표지자들은 종종 핵이나 세포체에 국한되어 있기 때문에 OPC 성숙과 분화 과정 동안 세포 수를 세고 추적하는 데 이상적입니다. Olig2는 올리고덴드로사이트의 증식과 분화에 관여하는 중요한 전사 인자입니다. OPC의 핵에서 발현되며 성숙한 올리고덴드로사이트에서도 계속 발현됩니다. PDGFRα는 혈소판 유래 성장 인자(PDGF)에 결합하는 세포 표면 수용체입니다. 초기 OPC의 표지자이며, OPC의 증식과 생존에 중요합니다. PDGFRα 발현은 일반적으로 성숙한 올리고덴드로사이트로 분화하면서 감소합니다. NKX2.2는 성숙한 올리고덴드로사이트로 분화하는 OPC의 분화에 중요한 역할을 하는 전사 인자입니다. 핵에서 발현되며, 올리고덴드로사이트 성숙과 수초화에 필요한 유전자의 조절에 관여합니다.
다수의 조직 섹션에서 미엘린 기본 단백질(MBP)에 대한 면역조직화학 염색을 통해 , 5주 동안컵리즈론 식이요법을 받은생쥐의 뇌량 중앙선에서 탈수초화를 강조합니다 .
전자 현미경(Electron Microscopy,EM)
전자 현미경 은 조직 샘플의초고해상도 이미지를제공하여 세포 및 세포 내 수준에서 미엘린 구조와 래핑의 정교한 세부 사항을 제공합니다(Cruz-Martinez, 2016).그것은 미엘린화된 축삭의 g-비율을결정하는 데활용 되며, 발달적으로 미엘린화된 축삭과 재미엘린화된 축삭을 구분하는 데 탁월한 기술입니다.그러나,그것은 조직의아주 작은 부분만을샘플링하고 ,큐프리즈 모델에서는 뇌량을 통한 탈수초화 또는 재수초 화의 정도에 대한 통찰을 촉진하지않습니다.
g-ratio 계산의 예
생체 내 영상
(생체 내 자기공명영상) 전임상 자기공명영상(MRI) 과 확산텐서영상(DTI)은 물의 확산이 조직별로 특성이 다르기 때문에 조직의 구조적 평가를 가능하게 합니다. 수초 축삭은 특징적인 제한적이고 방향성 DTI 신호를 나타냅니다 (Wang, 2019). 이러한 기술은 생체 내 평가로 수행할 수 있으며, 수초 변화의 진화에 대한 통찰력을 제공하고 전임상 효능 연구에서 임상 시험으로 완전히 번역할 수 있습니다(예: 번역적 바이오마커 )(Sommer, 2022).
자기화 전달 비율(Magnetization Transfer Ratio, MTR) (Tagge, 2016)은 유리수와 고분자 결합수 사이의 자기화 전달을 측정함으로써 미엘린 함량에 대한 통찰력을 제공하는 또 다른 MRI 기법입니다. 이 방법은 DTI와 마찬가지로 생체 내 평가로 수행할 수 있으며, 미엘린 변화의 진화에 대한 귀중한 정보를 제공합니다. MTR은 전임상 효능 연구에서 임상 시험으로 전환할 수도 있습니다 (Sommer, 2022).
비침습적, 종단적, 생체 내 평가, MRI, DTI, MTR을 위한 강력한 도구는 현미경 평가를 허용하지 않고 부종으로 인해 혼란을 야기할 수 있지만, 혈관성 부종이 중요한 역할을 하지 않는다는 점을 감안할 때, 이 문제는 큐프리즈온 모델에 대한 특별한 고려 사항이 아닙니다.
전임상 치료 효능 연구에서 탈수초화 및 재수초화를 측정하는 데 있어 고려해야 할 실용적인 사항은 무엇입니까?
약물 개발 연구의 일환으로 전임상 치료 효능 연구를 위해 큐프리존 모델을 사용할 때 고려해야 할 중요한 사항은 개입과 종점 판독 모두에 적합한 시간 창을 결정하는 것입니다. 개입 시점은 치료제의 약동학(PK)과 표적 세포 유형을 고려해야 합니다 .
종 종 치료 효과는 탈수초화 및 재수초화 단계의 속도를 변화시키지만, 궁극적으로 모델은 매우 유사한 최종 재수초화 상태로 해결됩니다. 따라서 최종 평가에 가장 적합한 시기를 선택하는 것도 중요합니다. 탈수초화 및 재수초화 과정은 서로 다른 시간 프레임에 걸쳐 발생한다는 점을 감안할 때, 이러한 과정의 역학을 파악하기 위해서는 여러 시점을 평가해야 합니다 .
객관적이고 재현 가능한 정량화를 위해서는 적절한 병리학적 평가를 선택 하는 것이 필수적입니다. 조직 준비 및 절편을 통해 가장 큰 영향을 받은 뇌량 영역에 병리학적 현상을 집중적으로 국한시키는 것이 여러 집단 간의 비교를 위해 중요합니다 .
생체 내 영상 기술을 활용하면 탈수초성 및 재수초성 병변의 진화와 해결에 대한 통찰력을 극 대화할 수 있습니다 . 확산 텐서 영상(DTI) 및 자기화 전이 영상(MTR)과 같은 기술은 백질의 완전성에 대한 통찰력을 제공합니다. MRI를 이용한 종단 연구는 동일한 동물에 대해 반복 측정을 가능하게 함으로써 질병 진행과 치료 효과를 추적할 수 있게 해줍니다 .
저희 팀은 큐프리존 마우스 모델에 대한 질문이나 치료 효능 연구에 사용하는 MS 모델에 대한 구체적인 정보를 제공해 드릴 수 있어 기쁩니다.
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이 자료는 다발성 경화증(MS)의 EAE 모델에서 조직 마커와 혈장 및 뇌척수액의 신경필라멘트 경쇄(NfL; NF-L) 수준을 포함하여, 축삭 손상 및 축삭 퇴화를 측정하는 데 사용할 수 있는 방법을 설명합니다.